Beclin1介导Ferroptosis在异氟醚诱导细胞毒性中的作用和机制研究
发布时间：2020-08-10 12:43
【摘要】：卤族吸入麻醉剂由于其高效率和易控制性在临床实践中被广泛地使用。但多年来研究已经认识到异氟醚等吸入麻醉剂本身具有神经毒性,诱发动物和人类神经病理学改变。回顾性病例分析报道了手术和麻醉对认知轨迹的潜在影响,证实异氟醚与学习记忆损伤,认知功能障碍及神经退行性疾病的发生发展关系密切,是人类中枢神经系统潜在的有害风险。因此,吸入麻醉剂诱导神经毒性的机制研究对指导患者安全适用吸入全身麻醉剂具有重要意义。异氟醚诱导的神经毒性损伤与神经元缺失、神经元炎症和神经元异常蛋白聚集有关,神经元死亡、减少是公认麻醉药物致神经毒性作用的主要因素。Ferroptosis是近年来提出的新概念,描述了一种依赖铁代谢障碍的致命性脂质过氧化引起的调节性细胞死亡形式。Ferroptosis在形态学,生物化学,和遗传学上不同于细胞凋亡,细胞自噬及其他形式的细胞坏死。研究表明Ferroptosis涉及多种病理生理状态,包括,急性组织损伤,肿瘤抑制,缺血/再灌注损伤,血色病,和神经变性等病理过程。事实上,Ferroptosis,凋亡与自噬之间存在信号交叉,Erastin诱导ferroptosis水平在Beclinl沉默细胞中明显被抑制。在某些条件下,Ferroptosis病变更可能是与细胞氧化应激毒性相关的潜在机制。在神经退行性疾病的背景下,神经元中观察到还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)活性降低,铁超载和脂质过氧化。异氟醚暴露后,离体脑组织及体外培养神经元细胞中氧化应激损伤明显。因此,我们假设Ferroptosis可能参与异氟醚诱导的细胞损伤甚至神经毒性作用。目前Ferroptosis与临床应用剂量下异氟醚诱细胞毒性反应之间的作用关系及及可能的调节机制尚没有研究报道。目的:本研究旨在了解异氟醚诱导细胞毒性损伤程度,同时探讨Ferroptosis在异氟醚诱导的细胞毒性损伤中的作用及可能的调控机制,补充异氟醚致神经毒性的调节机制。方法:1)选用类神经元细胞人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y为研究对象;2)Beclin1过表达质粒和siRNA瞬时转染细胞,建立Beclin1过表达和沉默的细胞模型;3)将细胞暴露于不同浓度异氟醚的密闭箱内建立麻醉细胞模型;4)CCK-8(cell counting Kit-8)检测细胞存活率;5)RT-qPCR(Rea1-time quantitative polymerase chain reaction)检测 mRNA 表达水平变化;6)Western blot 检测蛋白质表达水平变化;7)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)检测蛋白质间相互作用;8)免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测蛋白质细胞定位;9)流式细胞术检测细胞凋亡,脂质过氧化,和细胞内螯合铁水平变化;10)试剂盒检测丙二醛(Malondialdehyde,MDA),GSH,和谷氨酸释放变化。结果:1.多种损伤机制调节异氟醚诱导细胞损伤Microtubule-associated protein2(MAP2)是神经元特异性细胞骨架蛋白,是神经元表型的标志物。SH-SY5Y细胞中MAP2的染色阳性,以证实SH-SY5Y细胞的一般神经元特性。SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度的异氟醚,CCK-8法检测异氟醚暴露后的细胞存活率下降呈浓度依赖性(1.2%,2.4%,4.8%)和时间依赖性(6h,12h,24h,48h)。异氟醚(1.2%,2.4%,4.8%)处理 24h 后,流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡水平增加,与未处理对照组相比从3.63%分别增加到 7.75%,8.1%和 10.83%。Western blot 显示 LC3-Ⅱ/-Ⅰ 比值增加 1.2,1.6 和1.9倍,p62蛋白水平分别下调至88%,75%,和59%。提示异氟醚暴露能诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡和自噬。异氟醚诱导的细胞毒性包含多种调节性细胞死亡过程。SH-SY5Y细胞分别与 Z-VAD-FKM,雷帕霉素,Necrostatin-1(Ner-1),Ferrostatin-1(Fer-1),Deferoxamine mesylate(DFOM)和异氟醚(1.2%或 2.4%)共培养 12h 或 24 h。五种抑制剂均改善了 1.2%异氟醚暴露引起的细胞活力的降低,并且五种药物间对细胞活力的影响没有显著差异。而2.4%异氟醚培养24小时后,仅Fer-1和DFOM显著抑制了细胞活力的降低。这些结果表明,抑制ferroptosis对于抑制较高浓度异氟醚诱导细胞活力下降更为有效。2.异氟醚诱导ferroptosis异氟醚处理SH-SY5Y细胞24h后,脂质过氧化标记物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表达水平以浓度依赖性(1.2%,2.4%)方式增加了 1.3倍和1.5倍,荧光探针从还原型(红色)C11-BODIPY转变为氧化型(绿色)C11-BODIPY,流式细胞术结果显示氧化型C11-BODIPY从3.43%增加到23.8%和27.8%。荧光显微镜分析,异氟醚减弱了金属指示剂Phen GreenTM SK的荧光量。流式细胞术分析荧光量从38.67%依次减弱到12.33%和7.67%。此外,异氟醚诱导24h后,SH-SY5Y细胞内GSH水平以浓度依赖性(1.2%,2.4%)显著降低1.4倍和1.72倍。以上三种实验表明SH-SY5Y细胞脂质过氧化,铁超载,和还原水平下降,提示异氟醚以浓度依赖性诱导ferroptosis。3.异氟醚对ferroptosis相关调节通路的影响异氟醚处理SH-SY5Y细胞24h后,调节铁转入细胞内的主要基因:铁蛋白受体 1(transferrin receptor 1,TFRC),前列腺3 的六跨膜上皮抗原(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3),二价金属转运蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)的mRNA和蛋白水平没有明显改变。RT-qPCR和western blot结果表明调节铁输出和储存的膜蛋白铁转运蛋白(ferroportin,FPNl)mRNA和蛋白水平水平同样无明显改变,提示铁代谢相关途径可能被动参与异氟醚诱导的ferroptosis。对于system Xc-/GSH/GPX4,异氟醚诱导后,RT-qPCR和western blot显示人谷胱甘肽过氧化物酶4(Anti;-glutathione peroxidase 4,GPX4)的 mRNA 和蛋白质水平变化不明显,但外源性补充GSH后,CCK-8检测细胞存活率下降被显著改善。推断影响GSH活力变化的上游可能是异氟醚诱导ferroptosis的关键过程。异氟醚诱导后,尽管RT-qPCR结果显示system Xc-催化亚基溶质载体家族7 成员 11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的 mRNA 水平上调,但western blot检测其蛋白质水平没有显著变化。荧光定量检测细胞外谷氨酸释放水平以异氟醚浓度依赖性(1.2%,2.4%)降低,分别为对照组的80%及55%。这些结果表明,异氟醚诱导ferroptosis可能与谷氨酸/胱氨酸转运障碍关系密切。4.异氟醚诱导Beclin1磷酸化并形成Beclin1-SLC7A11复合物异氟醚暴露后,western blot结果显示ser93位点的Beclin1磷酸化水平呈浓度依赖性(1.2%,2.4%,4.8%)增高。SH-SY5Y细胞给予2.4%异氟醚诱导24 h后,免疫共沉淀结果显示对照组中,IP:Beclin1,与其结合的SLC7A11水平极低,而异氟醚暴露后与Beclinl相互结合的SLC7A11水平显著增高。反相验证IP:SLC7A11得到相同结果。免疫荧光染色结果所示,Belin1与SLC7A11之间的共定位主要发生在SH-SY5Y细胞的胞质中。以上结果提示异氟醚诱导Beclin1磷酸化并引起Belin1与SLC7A11发生蛋白质相互作用。5.过表达Beclin1增强异氟醚诱导ferroptosis和细胞毒性。Beclin1-cDNA瞬时转染SH-SY5Y细胞,建立Beclinl过表达的细胞模型。Western blot检验Beclinl表达量明显增高2倍以上。2.4%异氟醚诱导24 h后,空载体对照组Bedinl-SLC7A11复合物增加3.8倍。过表达Beclin1后,异氟醚使二者结合水平进一步增加至4.85倍。与空载体细胞对照,在Beclin1-cDNA细胞中,异氟醚诱导使谷氨酸释放进一步被抑制(0.58 vs 0.42),GSH活力进一步被抑制(0.63 vs 0.43),MDA 水平进一步增高(1.58 vs 2.02),氧化型 C11-BODIPY荧光量进一步增高(24.34%vs 36.67%)。提示过表达Beclin1后,异氟醚诱导ferroptosis敏感性增加。空载体对照组给予异氟醚诱导24 h后,CCK-8检测细胞存活率下降为62%。过表达Beclin1后,异氟醚使细胞存活率进一步下降为45%。提示过表达Beclin1加重了异氟醚诱导的细胞毒性。6.抑制Beclin1抑制异氟醚诱导ferroptosis和细胞毒性。Beclin1-siRNA瞬时转染SH-SY5Y细胞,建立Beclin1沉默的细胞模型。Western blot检验Beclin1表达量明显降低,沉默效率60-70%。2.4%异氟醚诱导24h后,阴性对照组Beclin1-SLC7A11复合物增加3.02倍。过表达Beclin1后,异氟醚使二者结合水平明显下降为1.13倍。同时,与空载体组对比Bedin1RNAi细胞中,异氟醚诱导使谷氨酸释放被抑制得到改善(0.55 vs 0.85),GSH活力下降程度减弱(0.65 vs 0.87),增高的MDA水平得到下降(1.45 vs 1.19),增高的氧化型C11-BODIPY水平降低(25.67%vs 4.61%)。提示过抑制Beclin1后,异氟醚诱导ferroptosis敏感性下降。阴性对照组给予异氟醚诱导24 h后,CCK-8检测细胞存活率下降为64.8%。在Beclin1RNAi细胞中,异氟醚暴露使细胞存活率下降得到改善(0.64 vs 0.77)。提示抑制Beclin1减弱了异氟醚诱导的细胞毒性。结论:1.异氟醚诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡、自噬等多种损伤调节机制中,铁死亡可能发挥主要作用。2.异氟醚诱导SH-SY5Y细胞ferroptosis呈浓度依赖性。3.异氟醚诱导SH-SY5Y细胞Beclinl磷酸化并形成Belin1-SLC7A11复合物。4.Beclin1通过调控system Xc-的活力影响异氟醚诱导的细胞ferroptosis。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R614
【图文】：
再灌注损伤，癌症和神经系统退行性疾病等在内的许多病理状况的具有独特相关逡逑性，尽管这些研究尚处于起步阶段［１１２＊１１３］。了解ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ的分子机制和相关信逡逑号通路（图１．１），为调节人类疾病中的细胞存活和死亡，提供新的可能的诊断和逡逑治疗方法。逡逑Ｃｙｓｔｉｃ邋ａ邋Ｇｌｕｔａｍａｔ？逡逑_尽ⅲ幔徨濉㈠危椤义希ǎ停簦颍铮悖颍妫妫酰瑁蝈危苠澹校澹颍
本文编号：2788093
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R614
【图文】：
再灌注损伤，癌症和神经系统退行性疾病等在内的许多病理状况的具有独特相关逡逑性，尽管这些研究尚处于起步阶段［１１２＊１１３］。了解ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ的分子机制和相关信逡逑号通路（图１．１），为调节人类疾病中的细胞存活和死亡，提供新的可能的诊断和逡逑治疗方法。逡逑Ｃｙｓｔｉｃ邋ａ邋Ｇｌｕｔａｍａｔ？逡逑_尽ⅲ幔徨濉㈠危椤义希ǎ停簦颍铮悖颍妫妫酰瑁蝈危苠澹校澹颍
本文编号：2788093
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