靶向TLR2联合促渗剂增加基因透皮效率的作用及机制研究

发布时间：2020-08-26 11:33

【摘要】：第一章：促渗剂二甲基亚砜在小鼠透皮实验中的最适浓度研究研究目的：检测二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)的不同浓度是否影响报告基因pORF-LacZ透过小鼠皮肤的转染效率以及探讨DMSO在促进报告基因pORF-LacZ经皮渗透效率过程中的最适浓度,为二期实验中应用最适浓度的DMSO制剂促进pORF-LacZ基因透过皮肤(皮瓣)作进一步研究奠定理论基础。研究方法：选取8周龄清洁级健康雄性Balb/c小鼠(购买于南方医科大学动物实验中心)20只,体重20—-22g,实验室环境：环境温度为22.0±2.0℃,相对湿度55.6%±4%。按浓度不同随机分为0%DMSO组,5%DMSO组,10%DMSO组,30%DMSO组4组,每组5只小鼠。DMSO配方的浓度主要以在总体积150μl中DMSO所占百分比为基础,各配方中DMSO的浓度分别为30%(formula1),10%(formula2),5%(formula3),0%(formula4),每个配方中均含有150ug的报告基因pORF-LacZ质粒。按如下步骤操作：每只小鼠以1%戊巴比妥钠溶液进行腹腔注射麻醉后固定,于小鼠背部中央设计一个蒂在头侧的模拟随意型皮瓣(蒂宽1cm、长3cm),在转染皮肤之前,脱毛膏背部脱毛,3-5min后,用0.9%氯化钠溶液(生理盐水)处理15min,随后于小鼠背部皮瓣相应区域涂抹20u1含0.05%维甲酸(retinoic acid, RA)(维甲酸溶于0.9%氯化钠溶液中)、20u1的浓度为1%Toll样受体2(Toll like receptor2,TLR2)抑制剂--脂质羊毛硫氨酸肽(lipolanthionine peptides,LP)及DMSO混合制剂,这个过程每隔一天进行一次,连续1周。到第7天,当涂抹最后一次DMSO、LP和RA混合制剂4小时后,用移液器吸取10ul的混合物(150ug的pORF-LacZ和15u1的不同浓度DMSO溶于水中,总体积为150u1)均匀地涂抹于小鼠背部皮瓣上,这个过程进行3天,每天1次。第4天于皮瓣下部收集透过的质粒,样本分成两份,实时荧光定量PCR检测pORF-lacz基因透过量。用水合氯醛麻醉实验小鼠,然后进行处死,并收集它们的背部皮肤样本。样本先用PBS溶液处理,而后被固定在带有一定扩散面积的扩散池中,此处包括有测定位点隔间和受体隔间,且两种隔间分别被安装在扩散池的两侧。皮肤表面朝向测定位点隔间的一侧,受体隔间中充满RPMI1640培养基,此实验过程中,pEGFP-N1质粒(5ug)被加入到培养基中作为内参。已经准备好的基于不同浓度的DMSO等混合制剂被加到测定位点隔间。受体隔间中的培养基在整个实验当中以45转/min的转速进行搅拌。整个装置被置于37.0±0.5℃的环境条件下。取样后,背部皮肤在2%的甲醛和0.2%的戊二醛的混合液当中浸泡2-4小时,溶液的温度保持在4℃的环境下,然后在室温下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60min,接着所有的样本在37.0℃的环境下被置于1mg/ml X-gal当中浸泡过夜。第2天,所有的样本在室温条件下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60min,接着在室温条件下被放置于10%福尔马林溶液当中浸泡24小时,然后用水冲洗过夜。研究结果：在不同浓度DMSO混合制剂的作用下,报告基因pORF-lacz透皮表达量分别为(F=337.718)： a.当DMSO浓度为10%时,pORF-lacz基因透皮表达量最高(5.378±0.346μg/cm2), 显著性高于另外三组,P=0.000,差异具有统计学意义； b. DMSO浓度为0时,pORF-lacz基因透皮表达量最低(0.940±0.095μg/cm2),显著性低于另外三组,P=0.000,差异具有统计学意义； c.而DMSO浓度为5%和30%时,pORF-lacz基因透皮表达量居中(分别为2.376±0.190μg/cm2和2.516±0.199μg/cm2),两者之间差异并无统计学意义。结论：当DMSO浓度为10%时,报告基因pORF-lacz透皮表达量最高,可确定此为促进报告基因透过小鼠皮肤的最适使用浓度,因此在本课题进一步研究中,将选用浓度为10%的DMSO作为关键促渗剂。第二章：RA和LP对小鼠皮肤claudin-4和ZO-1影响的实验研究研究目的：探讨经10%DMSO作为促渗剂,维甲酸(retinoic acid, RA)和Toll样受体2(Toll like receptor2,TLR2)抑制剂--脂质羊毛硫氨酸肽(lipolanthionine peptides,LP)按照分组施加干预后,小鼠皮肤连接蛋白claudin-4和ZO蛋白-1(ZO-1)表达的改变情况和皮肤相应透过功能的变化规律。研究方法：选取8周龄清洁级健康雄性Balb/c小鼠(购买于南方医科大学动物实验中心)30只,体重20-22g。实验室环境：环境温度为22.0±2.0℃,相对湿度55.6%±4%。将小鼠随机分为5组：RA+LP+DMSO+pORF-LacZ; DMSO+pORF-LacZ; LP+DMSO+pORF-LacZ; RA+DMSO+pORF-LacZ;生理盐水对照组,每组6只。按如下步骤操作：选取8周龄小鼠背部一定面积(1cm×1cm)的皮肤,用脱毛膏脱出此选定皮肤区域的毛发,3-5min后,用0.9%氯化钠溶液处理,15mmin后,按照分组,小鼠背部皮肤分别被涂抹20u1含0.05%维甲酸(RA)(维甲酸溶于0.9%氯化钠溶液中)+10%DMSO制剂和20u1的浓度为1%TLR2抑制剂LP+10%DMSO制剂,或者涂抹两者的联合制剂+10%DMSO制剂,或者10%DMSO制剂,这个过程每隔一天进行一次,连续1周,对照组作同样处理。第7天,最后用上述相应制剂处理后,施用最适浓度10%DMSO配置的pORF-LacZ质粒,处理过程进行3天,每天1次,第4天处死小鼠,收集皮肤标本,然后运用皮肤免疫组化和western blot检测紧密连接蛋白claudin-4和ZO蛋白-1(ZO-1)的表达情况。背部皮肤在2%的甲醛和0.2%的戊二醛的混合液当中浸泡2-4小时,溶液的温度保持在4℃C的环境下,然后在室温下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60mmin,接着所有的样本在37.0℃C的环境下被置于1mg/ml X-gal当中浸泡过夜。第2天,所有的样本在室温条件下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60mmin,接着在室温条件下被放置于10%福尔马林溶液当中浸泡24小时,然后用水冲洗过夜。研究结果： 1.根据HE染色图片所示：DMSO、RA和LP干预后的实验组小鼠皮肤角质层细胞连接间隙增大,细胞连接疏松,生理盐水对照组小鼠的皮肤并未出现上述现象；所有的实验组小鼠皮肤并未出现病理性的破坏。在各实验组中,DMSO组和RA+DMSO组小鼠皮肤略微出现了皮肤乳头状突起、皮肤水肿、中性粒细胞聚集和毛细管扩张等现象,与之相比,LP+DMSO组和RA+LP+DMSO组的小鼠皮肤水肿现象减少,毛细血管扩张现象有所缓解。 2.免疫组化实验结果： (1)claudin-4的表达情况(F=16.174,P=0.000)： a.与盐水对照组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ两组目的蛋白-claudin-4的表达量(分别为29.827±2.849、32.932±4.890)显著低于前者的蛋白表达(42.830±3.865)(p0.01),差异具有显著统计学意义； b.与RA+DMSO+pORF-LacZ相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白-claudin-4的表达量(29.827±2.849)显著低于前者的蛋白表达(39.388±2.053)(p0.01),差异具有显著统计学意义； c.LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白-claudin-4的表达量(32.932±4.890)低于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达(39.388±2.053)(p0.05),差异具有统计学意义； d.与DMSO+pORF-LacZ组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ LP+DMSO+pORF-LacZ两组目的蛋白-claudin-4的表达量(分别为分别为29.827±2.849、32.932±4.890)显著低于前者的蛋白表达(40.202±1.872)(p0.01),差异具有统计学意义。 (2)zo-1蛋白表达情况(F=97.827,P=0.000)：a.与盐水对照组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、 RA+DMSO+pORF-LacZ、DMSO+pORF-LacZ四组目的蛋白—zo-1的表达量(分别为21.367±1.892、31.613±0.911、32.047±1.976、34.697±1.748)显著低于盐水对照组的蛋白表达量(41.473±2.174)(p0.01),差异具有显著统计学意义；b.RA+LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白——zo-1的表达量(21.367±1.892)显著低于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达量(32.047±1.976)(p0.01),盐水对照组目的蛋白表达量(41.473±2.174)显著高于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达量(32.047±1.976)(p0.01),差异具有显著统计学意义； c.DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—-zo-1的表达量(34.697±1.748)高于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达(32.047±1.976)(p0.05),差异具有统计学意义； d.与DMSO+pORF-LacZ组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ组目的蛋白—zo-1的表达量(分别为21.367±1.892、31.613±0.911)显著低于前者(34.697±1.748)(p0.01),差异具有显著统计学意义。 e.RA+LP+DMSO+pORF-Lac组目的蛋白—zo-1的表达量显著低于LP+DMSO+pORF-LacZ组表达量(分别为21.367±1.892、31.613±0.911)(p0.01),差异具有显著统计学意义。 3.Western blot实验结果： (1)claudin-4的表达情况(F=124.557,P=0.000)： a.与盐水对照组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、 RA+DMSO+pORF-LacZ三组目的蛋白-claudin-4的表达量(分别为0.208±0.018、0.241±0.020、0.285±0.017)显著低于前者的蛋白表达(0.458±0.031)(p0.01),差异具有统计学意义； b.与DMSO+pORF-LacZ组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ、RA+DMSO+pORF-LacZ三组目的蛋白-claudin-4的表达量(分别为0.208±0.018、0.241±0.020、0.285±0.017)显著低于前者的蛋白表达(0.410±0.030)(p0.01),差异具有统计学意义。 c.与RA+DMSO+pORF-LacZ组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ组目的蛋白-claudin-4的表达量(分别为0.208±0.018、0.241±0.020)显著低于前者的蛋白表达(0.285±0.017)(p0.01),差异具有统计学意义； d. RA+LP+DMSO+pORF-LacZ组目的蛋白-claudin-4的表达量低于LP+DMSO+pORF-LacZ组(分别为0.208±0.018、0.241±0.020)(p0.05),差异具有统计学意义； (2)zo-1蛋白表达情况(F=64.080,P=0.000)：a.与盐水对照组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、 RA+DMSO+pORF-LacZ三组目的蛋白—zo-1的表达量(分别为0.541±0.054、0.789±0.076、0.955±0.064)显著低于前者的蛋白表达(1.129±0.093)(p0.01),差异具有统计学意义； b.与DMSO+pORF-LacZ相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ两组目的蛋—zo-1的表达量(分别为0.541±0.054、0.789±0.076)显著低于前者的蛋白表达(1.067±0.069)(p0.01), RA+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—zo-1的表达量(0.955±0.064)低于DMSO+pORF-LacZ组蛋白表达(1.067±0.069)(p0.05),差异具有统计学意义；c.与RA+DMSO+pORF-LacZ组相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ两组目的蛋白—zo-1的表达量(分别为0.541±0.054、0.789±0.076)显著低于前者蛋白表达(0.955±0.064)(p0.01),DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—-zo-1的表达量(1.067±0.069)高于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达(0.955±0.064)(p0.05),差异具有统计学意义。 d. RA+LP+DMSO+pORF-LacZ组目的蛋白—zo-1的表达量显著低于LP+DMSO+pORF-LacZ组(分别为0.541±0.054、0.789±0.076)(p0.05),差异具有统计学意义。结论：LP/RA/DMSO单独或者联合干预均能不同程度地降低小鼠皮肤claudin-4、zo-1蛋白表达量,其中,LP+RA+DMSO干预的效果最为明显,LP+DMSO次之,RA+DMSO再次,说明通过TLR2抑制剂LP抑制TLR2信号通路可以下调小鼠皮肤连接蛋白claudin-4和ZO-1的表达,降低皮肤紧致度,改变紧密连接(tight junction,TJ)的固有结构,从而为增加报告基因pORF-LacZ对小鼠皮肤的透过效率创造条件。但是此过程中claudin-4、ZO-1的表达降低和TJ皮肤屏障作用改变的程度和时限需要进一步研究和评估,以保障皮肤正常的防御能力不受影响。TLR2抑制剂LP不仅能够增强小鼠皮肤对药物或者基因的透过效率,同时也能减轻DMSO所引起的微小皮肤损害,可以作为一种有效而安全的药物或者基因透过皮肤的增强剂。本实验为今后将治疗基因或者药物通过透皮传输发挥治疗作用奠定研究基础。第三章：RA和LP对pORF-lacz基因透皮效率影响的实验研究研究目的：经10%DMSO作为促渗剂,维甲酸(RA)和TLR2抑制剂--脂质羊毛硫氨酸肽(LP)按照分组施加干预后,测定报告基因pORF-lacz透过小鼠皮肤进入血液中数量的情况,以此探讨LP/RA/DMSO对基因透皮效率的影响。研究方法：选取8周龄清洁级健康雄性Balb/c小鼠(购买于南方医科大学动物实验中心)30只,体重20-22g。实验室环境：环境温度为22.0±2.0℃,相对湿度55.6%±4%。将小鼠随机分为5组：RA+LP+DMSO+pORF-LacZ; DMSO+pORF-LacZ; LP+DMSO+pORF-LacZ; RA+DMSO+pORF-LacZ;生理盐水对照组,每组6只。按如下步骤进行操作：选取8周龄小鼠背部一定面积(1cm×1cm)的皮肤,用脱毛膏脱出此选定皮肤区域的毛发,3-5min后,用0.9%氯化钠溶液处理,15min后,按照分组,小鼠背部皮肤分别被涂抹20u1含0.05%维甲酸(RA)(维甲酸溶于0.9%氯化钠溶液中)+10%DMSO制剂和20u1的浓度为1%TLR2抑制剂LP+10%DMSO制剂,或者涂抹两者的联合制剂+10%DMSO制剂,或者10%DMSO制剂,这个过程每隔一天进行一次,连续1周,对照组作同样处理。第7天,最后用上述相应制剂处理后,施用最适浓度10%DMSO配置的pORF-LacZ质粒,处理过程进行3天,每天1次,第4天处死小鼠,收集血液标本,随后应用RT-PCR检测血液中的pORF-LacZ质粒表达量。研究结果： a.盐水对照组的pORF-LacZ基因透皮表达量最低(0.897±0.228μg/cm2), RA+LP+DMSO组的pORF-LacZ基因透皮表达量则最高(5.310±0.273μg/cm2),差异具有统计学意义(p0.01)； b. LP+DMSO组(3.632±0.219μg/cm2)、RA+DMSO组(2.948±0.289μg/cm2)和DMSO组(2.070±0.23μg/cm2)的基因透皮表达量都低于RA+LP+DMSO组(5.310±0.273μg/cm2)(p0.05)、显著高于盐水对照组(0.897±0.228μg/cm2)(p0.01),差异具有统计学意义。 c. LP+DMSO组、RA+DMSO组和DMSO组三组之间比较：LP+DMSO组的基因透皮表达量(3.632±0.219μg/cm2)最高,DMSO组基因透皮表达量(2.070±0.231μg/cm2)则最低,差异具有统计学意义(p0.05)。F=265.903,P=0.000 结论：LP/RA/DMSO单独或者联合干预均能不同程度地提高报告基因pORF-LacZ的透皮表达量,其中,LP+RA+DMSO干预的效果最为明显,LP+DMSO次之,RA+DMSO再次,与干预后小鼠皮肤claudin-4、zo-1蛋白表达量下降程度相一致,说明通过LP抑制TLR2信号通路可以增加报告基因pORF-LacZ对小鼠皮肤的透过效率,其机制可能是通过下调小鼠皮肤连接蛋白claudin-4和ZO-1的表达,降低皮肤紧致度,暂时打破紧密连接(tight junction,TJ)所起的皮肤屏障作用。今后将进一步研究如何改进LP/RA/DMSO的配比效率,并对某些具体药物或者治疗基因的透皮表达量进行详细研究,观察LP/RA/DMSO制剂对药物和基因透皮吸收并改善皮瓣缺血损伤、提高皮瓣成活率的作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965
【图文】：

溶解曲线,实时荧光定量PCR,统计学意义

Figure 5 The RT-PCR dissolution curve of GAPDH表1，图1均表不在不同浓度DMSO混合制剂作用下，报告基因pORF-lacz的各透皮表达量。本研究各组数据均采用均数±标准差（7±s)表示。运用SPSS17.0版统计软件包进行分析。不同DMSO浓度的组间多重比较采用LSD检验（正太分布并且方差齐时）或者Tamhane’s T2(M)检验（方差不齐时）。P<0.05表示差异具存统计学意义；po.oi表示差异具Q囅灾酝臣蒲б庖濉II表1，图1"]■知在不同浓度DMSO混合制剂的作用下，报告基因pORF-lacz透皮表达量分别为：a.当DMSO浓度为10%时，口011?七02基因透皮表达量最高(5.378±0.346^18/咖2；),显著性高于另外三组，差异具Q囃臣蒲б庖澹籦.DMSO浓度为0时，pORF-lacz基因透皮表达量最低(0.940±0.095ng/cm2：)，显著性低于另外三组，差异具有统计学意义；C.而DMSO浓度为5%和30%时，pORF-lacz基因透皮表达量居中（分别为2.376±0.190^18/(012和2.516±0.199^ig/cm2)两者之间差异并无统计学意义。

组图,图片,实验组,小鼠

，M：：图6 干预后的实验组小鼠和对照组小鼠皮肤的HE染色注：图片A: RA+LP+DMSO组图片B: LP+DMSO组图片C: RA+DMSO组图片D; DM SO组图片E和图片F:盐水对照组根据HE染色图片所示：DMSO、RA和LP干预后的实验组小鼠皮肤角质层细胞连接间隙增大，细胞连接疏松，对照组小鼠的皮肤并未出现上述现象；所有的实验组小鼠皮肤并未出现病理性的破坏。在各实验组中，DMSO组和36

图片,对照组,免疫组化,实验组

注：图片 A: RA+LP+DMSO 组图片 B:LP+DMSO 组 C: RA+DMSO 组图片D:DMSO组图片E和图片F:盐水对照组目的蛋白呈阳性反应，呈现棕黄色。

【参考文献】