下丘脑穹窿周区星形胶质细胞在吸入麻醉觉醒过程中的作用研究

发布时间：2020-10-08 23:00

　　研究背景全身麻醉是指麻醉药物诱导产生的一种可逆的意识消失、镇痛和制动状态。全麻药物的应用极大地推动了医学特别是外科手术及无痛检查的发展,然而其作用的核心机制至今仍未被解析清楚。过去在全麻机制的研究中,着重于围绕神经元寻找全麻药物的作用靶点和相关机制。而星形胶质细胞作为大脑内数量最多的细胞,在全麻机制的研究中却一直未得到关注,相关报道罕见。研究证实星形胶质细胞参与睡眠-觉醒稳态调节,调控星形胶质细胞的活动既可产生促睡眠作用,亦可产生促觉醒效应。星形胶质细胞对睡眠-觉醒的双向调控作用是由其释放的多种胶质递质及能量物质所介导的,包括谷氨酸、腺苷、ATP、乳酸等。全身麻醉过程与睡眠有许多相似之处,也共享多条神经环路。已有大量证据表明,位于Pef区的Orexin神经元在睡眠-觉醒和麻醉-觉醒过程中为促觉醒神经元。然而,星形胶质细胞是否通过调控Orexin神经元参与麻醉觉醒的调节尚未见报道。本课题通过离体与在体两部分实验验证调控星形胶质细胞对Orexin神经元兴奋性的影响,进而观察了其对麻醉觉醒过程的调节,特别关注了星形胶质细胞源性乳酸是否介导这一过程。第一部分Pef区星形胶质细胞对Orexin神经元兴奋性调控作用的研究【目的】(1)观察FC抑制Pef区星形胶质细胞后,Orexin神经元兴奋性的变化。(2)观察FC抑制Pef区星形胶质细胞后,原代培养神经元兴奋性的变化。(3)观察化学遗传学手段抑制Pef区星形胶质细胞后Orexin神经元兴奋性的变化。(4)观察4-CIN抑制神经元乳酸转运体后,Orexin神经元兴奋性的变化。【方法】(1)4-6周龄,雄性C57BL/6小鼠。切取含Pef区的脑片,钳制细胞记录灌流FC(5μM)对Orexin神经元自发放电(n=7)、静息膜电位(n=7)、自发兴奋性突触后电流(n=5)、自发抑制性突触后电流的影响(n=5),四种指标的记录过程均为:基线5min,FC灌流5min,洗脱期10min。(2)取E18d胎鼠,原代培养神经元。记录灌流FC(5μM)前、后,神经元静息膜电位(n=6)的变化。(3)3-4周龄,Fgfr3-icre ERT小鼠。双侧Pef区注射AAV-EF1α-DIO-h M4Di-m CherryWPRE-p A病毒,病毒表达成功后,切取含Pef区的脑片,孵育后钳制细胞记录灌流CNO(10μM)对Orexin神经元自发放电(n=6)的影响。(4)4-6周龄,Orexin-GFP-2A-cre小鼠。切取含Pef区的脑片,孵育后钳制细胞记录灌流神经元乳酸转运体(MCT2)抑制剂4-CIN(0.5m M)后对Orexin神经元自发放电(n=5)的影响。【结果】(1)在脑片上,FC灌流后,Orexin神经元自发放电频率明显下降(**P0.01)。灌流后静息膜电位下降,绝对值增加(n=7,**P0.01),提示FC使Orexin神经元明显超极化,兴奋性降低。FC灌流后,Orexin神经元的s EPSC、s IPSC未见明显变化。(2)在原代培养的神经元,FC灌流后,神经元的静息膜电位未见明显变化。(3)化学遗传学抑制星形胶质细胞后,Orexin神经元的自发放电频率明显下降(*P0.05)。(4)在Orexin-GFP-2A-cre动物脑片上,4-CIN灌流后,Orexin神经元自发放电频率明显下降(*P0.05)。第二部分Pef区星形胶质细胞在Orexin神经元促麻醉觉醒中的作用研究【目的】(1)观察FC抑制Pef区星形胶质细胞后,小鼠异氟烷麻醉觉醒时间的变化。(2)观察化学遗传学手段抑制Pef区星形胶质细胞后,小鼠异氟烷麻醉觉醒时间的变化。(3)观察4-CIN抑制神经元乳酸转运体后,小鼠异氟烷麻醉觉醒时间以及脑电的变化。【方法】(1)8周龄,雄性C57BL/6小鼠,随机分为两组(n=6),单侧Pef区埋置微注射套管,一周后监测给予FC(1pmol)后异氟烷麻醉觉醒时间。将小鼠置于转筒中适应10min,打开麻醉机,维持氧流量为1L/min,异氟烷浓度为1.4%,小鼠翻正反射消失后通醚30min,停醚后记录小鼠翻正反射恢复时间,即麻醉觉醒时间。同样方法记录单侧Pef区给予50pmol(n=7)、100pmol(n=8)FC后,小鼠的翻正反射恢复时间。双侧Pef区置管,记录给予1pmol(n=8)、50pmol(n=8)、100pmol(n=8)FC后,小鼠的翻正反射恢复时间。(2)8周龄,雄性Fgfr3-icre ERT小鼠,随机分为两组(n=7)行双侧Pef区病毒微注射,其中实验组注射AAV-EF1α-DIO-h M4Di-m Cherry-WPRE-p A病毒200nl,对照组注射AAV-EF1α-DIO-m Cherry-WPRE-p A对照病毒,病毒表达两周后监测异氟烷麻醉觉醒时间,麻醉前15min腹腔注射CNO(1mg/kg),停醚后记录小鼠翻正反射恢复时间,即麻醉觉醒时间。(3)8周龄,雄性C57BL/6小鼠,随机分为两组(n=7),埋置单侧Pef区微注射套管,一周后监测予4-CIN(0.4nmol)后异氟烷麻醉觉醒时间。将小鼠置于转筒中适应10min,打开麻醉机,维持氧流量为1L/min,异氟烷浓度为1.4%,通醚30min,停醚后记录小鼠翻正反射恢复时间,即麻醉觉醒时间;同样的,记录双侧Pef区予4-CIN后小鼠(n=8)异氟烷麻醉翻正反射恢复时间;监测双侧Pef区予4-CIN后小鼠的异氟烷麻醉脑电变化。【结果】(1)单、双侧Pef区分别注射1pmol、50pmol、100pmol FC后小鼠翻正反射恢复时间无明显改变,与对照组相比均无统计学差异。(2)AAV-EF1α-DIO-h M4Di-m Cherry-WPRE-p A组小鼠给予CNO后动物麻醉翻正反射恢复时间与对照组相比无统计学差异。(3)单、双侧Pef区注射4-CIN后小鼠翻正反射恢复时间显著延长,与对照组相比均具有统计学差异(**P0.01),且双侧Pef注射4-CIN后小鼠翻正反射恢复时间较单侧延长。4-CIN组小鼠脑电时频图抑制性脑电波比例较对照组大。停醚后,对照组小鼠觉醒时,4-CIN组小鼠脑电仍表现为爆发性抑制波。【小结】(1)本课题第一部分离体电生理实验显示:利用FC药理学阻断及化学遗传学方法抑制星形胶质细胞后Orexin神经元的兴奋性明显下降。同时抑制星形胶质细胞源性乳酸向Orexin神经元转运后,Orexin神经元的兴奋性也明显受到抑制,提示星形胶质细胞源性乳酸在维持Orexin神经元兴奋性中发挥着重要作用。(2)第二部分在体实验的结果显示:给予乳酸转运体抑制剂4-CIN后延长了小鼠的翻正反射恢复时间;麻醉觉醒时间明显延长提示星形胶质细胞源性乳酸在促麻醉觉醒中发挥了重要作用。我们并未观察到用FC抑制星形胶质细胞的线粒体代谢、或化学遗传学方法阻断Pef区星形胶质细胞的功能对麻醉觉醒时间有显著影响,这可能与这些技术对星形胶质细胞部分功能影响的程度、给药的剂量等因素有关。(3)本研究证实Pef区星形胶质细胞在维持Orexin神经元兴奋性中发挥了重要作用,其中星形胶质细胞源性乳酸是介导这一效应的关键因素。在促麻醉觉醒行为研究中,抑制星形胶质细胞源性乳酸向神经元的转运后会导致麻醉觉醒时间的延长。本研究的结果,为干预麻醉觉醒的新策略提供了理论基础。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R614
【部分图文】：

麻醉药,星形胶质细胞,突触传递,突触

图 1.主要的麻醉药及临床首次运用时间[1]星形胶质细胞对神经元兴奋性的调控人类大脑由两类细胞组成：一类是神经元，另一类是神经胶质细胞。自 1846 年dolfVirchow 首次描述神经胶质细胞以来，科学界对胶质细胞，尤其是星形胶质细形态结构及功能做了广泛的研究。近期研究发现星形胶质细胞在神经元的营养、结构支撑、神经元兴奋性及突触传递的调控中均发挥着重要作用。神经元兴奋性是神经元活动和信号传递的基础，依赖于神经元本身的代谢活动触内外兴奋性和抑制性神经递质系统的调控。研究表明，星形胶质细胞能够很伸出和缩回很细的突起，接触或脱离动态的树状突起和轴突终末[13]。在许多突，星形胶质细胞的突起将突触前和突触后神经元的突触结构一起包裹起来形成联突触”结构[14]。“三联突触”是星形胶质细胞影响神经元兴奋性和突触传递构基础。目前观点认为，星形胶质细胞对神经元兴奋性和突触传递的调控主要

示意图,神经元,细胞,示意图

图2.A为钳制神经元示意图，B为自带荧光的Orexin神经元2）细胞钳制：将拉制好的电极内灌入约 1/3K+内液，电极尖端阻抗为 4-8MΩ。用玻璃注极轻微的正压以避免尖端被溶液中的杂质干扰，利用微操仪移动玻璃电液中，调整电极位置于屏幕中央，然后同时下调镜头与电极，使电极尖端胞表面正上方，将液接电位归零。再次以 μm/sec 级速度下调玻璃电极，面出现凹陷，且显示封接电阻增加了 0.1-0.2MΩ。此时撤去正压，并使用抽吸细胞膜给予负压，使封接电阻达 1GΩ，再将钳制电压钳制逐渐调至，等待 1min 左右至基线平稳后使用注射器短促负压吸引破膜，破膜后可充放电反应，形成全细胞钳制模式。3）神经元静息膜电位（RMP）及自发动作电位（AP）的记录：细胞破膜稳定 3-5 分钟后，转换至电流钳模式，正常灌流液灌流，记录更换含药物（FC）的灌流液记录 5min，再转换至正常灌流液记录 10min

神经元,兴奋性突触,突触传递

图 4.FC 对 Orexin 神经元自发的兴奋性突触后电流（sEPSC）及抑制性突触后电流（sIPSC）的影响。A）B）Orexin 神经元钳制到-70mV，阻断 GABA 突触传递，给予 FC 后 sEPSC 的频率和幅值未发生明显变化；C）D）Orexin 神经元钳制在+30mV，阻断 NMDA/AMPA 突触传递，给予 FC 后 sIPSC 的频率和幅值无明显变化；4.1.3 Orexin 神经元的鉴定为确保统计分析的数据均为 Orexin 神经元，我们记录时在电极内液中加入Biocytin，记录后进行 Orexin 神经元、Biocytin 免疫荧光染色。如图 5A 为 Orexin 神经元，5B 为 Biocytin 标记的神经元，5C 表示两者共定位。Scale bar=50μm

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