咪达唑仑对氯胺酮致胎鼠神经细胞自噬和凋亡保护作用的研究
发布时间：2020-10-12 20:24
麻醉是动物临床诊疗中的关键环节,然而麻醉也具有一定的副作用,如引起的神经变性,现在已引起广泛关注。氯胺酮是临床常用的静脉麻醉剂之一,由于其具有良好的镇痛作用而备受青睐,但同时它的神经毒性作用也是不容忽视的。据报道,包括咪达唑仑在内的一些麻醉药可起到保护神经元的作用,但咪达唑仑的神经保护作用机制尚不清楚。且对于咪达唑仑是否能减轻氯胺酮引起的损害,也尚不清楚。因此,为了解对孕鼠进行氯胺酮麻醉时,对胚胎造成的影响,本实验通过氯胺酮来麻醉孕鼠,以胎鼠为实验对象,研究氯胺酮对胎鼠脑神经元的影响,以及咪达唑仑在氯胺酮麻醉时是否能够起到保护作用。为今后寻找相对安全的麻醉方式提供理论依据。还可以为怀孕动物麻醉提供一些理论支持,尽量避免麻醉对幼子造成过多的伤害。将怀孕大鼠随机分为4组,在怀孕第19天时,对照组(C组)大鼠不进行任何处理,氯胺酮组(K组)大鼠肌注氯胺酮,咪达唑仑组(M组)大鼠肌注咪达唑仑,咪达唑仑+氯胺酮组(K+M组)大鼠同时肌注氯胺酮和咪达唑仑,进行剖腹产,取出胎鼠。采用Western-blot的方法检测自噬与凋亡的相关蛋白变化,如微管相关蛋白1轻链3(autophagy marker light chain3,LC3)、自噬相关基因4(autophagy-related gene 4,ATG4)、ATG5、Bcl-2同源结构域蛋白(Beclin-1)、切割的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved-caspase-3,c-caspase-3)、自噬底物P62蛋白(P62)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bcl-2 associated X protein,Bax)的蛋白变化;用氧化应激相关试剂盒来检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)。应用CCK-8试剂盒检测出氯胺酮、咪达唑仑和过氧化氢对PC12神经细胞的最佳药物作用浓度,随后建立氧化应激的细胞模型,以及加入自噬促进剂(Rapa)和抑制剂(3-MA)来进行离体验证。应用mRFP-EGFP-LC3双荧光自噬指示体系进行检测,用来研究对LC3的追踪以及自噬流的变化。再采用流式细胞术技术来检测氯胺酮对PC12细胞造成的凋亡影响,以及咪达唑仑在其中起到的作用。再通过Western-blot的方法测定自噬与凋亡相关蛋白的变化来再次验证得到的在体结果。结果发现:1.氯胺酮通过增加c-caspase-3和Bax的表达,并降低Bcl-2的表达来诱导胎鼠海马和PC12细胞发生细胞凋亡。2.氯胺酮也增加LC3II、Beclin-1和ATG5蛋白的表达,降低ATG4和P62的表达,最终诱导胎鼠海马和PC12细胞发生自噬。3.氯胺酮促进ROS和MDA的产生,降低T-AOC。4.K+M组与K组相比,自噬与凋亡相关蛋白有显著差异性(P0.05)。5.M组与C组相比,自噬与凋亡相关蛋白没有明显变化。结果表明氯胺酮麻醉导致胎鼠海马发生自噬和细胞凋亡。氯胺酮还通过ROS的产生来诱导凋亡途径和自噬的激活,从而在神经元中诱导毒性。咪达唑仑通过降低ROS的产生来改善氯胺酮对神经细胞的毒性作用。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S859.7
【部分图文】：
管理和样品收集怀孕的雌性大鼠随机分为以下 4 组（每组 n = 6）：对照组（C），氯胺酮M），氯胺酮和咪达唑仑联合组（K + M）。在 G19（相当于人类怀孕]时，让 C 组大鼠在笼中不受干扰；K 组大鼠通过肌肉注射氯胺酮（上买）（先按剂量为 80 mg/kg 进行肌肉注射，随后每隔 1 h 按剂量为 40 以保证氯胺酮稳定的血药浓度）；M 组大鼠通过肌肉注射咪达唑仑（，中国江苏）（剂量为 60 mg/kg）；K + M 组大鼠在通过肌肉注射氯胺 进行肌肉注射，随后每隔 1 h 按剂量为 40 mg/kg 进行补液三次）前 30 剂量为 60 mg/kg），氯胺酮的总体积小于 2 mL/100 g 体重，一共药物持这种输注方式诱导大鼠处于轻度麻醉和深度镇静之间的镇静状态，但不过翻正反射消失、肌肉紧张度减少和对疼痛的最小反应来确认是否达，通过断头方式来处死大鼠，并回收胎儿，剥离脑壳，将整个脑组织放皮层并收集海马组织（海马位置示意图如图 2-1）。海马组织收集后应存。本实验使用来自 3 个母鼠（3 个胎鼠/母鼠）的 9 只胎鼠。将取自胎儿的海马组织混合在一起，提取蛋白，将此混合的海马组织作为一一个数据。
果胺酮和咪达唑仑对胎鼠海马中自噬和凋亡相关蛋白表达施用氯胺酮后，LC3II、ATG5、Beclin-1、c-caspase-3 和 Bax 分别上调了 83.5%、132.844%和 104.9%，而 ATG4，自噬底物 P62 蛋白——P62（SQSTM1）和 Bcl-2 分别%、38.9%和 56.1%（见图 3-1）。M 组与 C 组相比，可以发现，没有明显的趋势变了更好的表达 LC3-I 与 LC3-II 和 Bax 与 Bcl-2 之间的转换，本实验做了 LC3-I/LC/Bcl-2 的比值柱状图。通过分析发现，K 组与 C 组相比，LC3-I/LC3-II 的比值发 Bax/Bcl-2 的比值变高（P<0.05，见图 3-1）；同时 M 组相对于 C 组无明显变化。
图 3-2 胎鼠海马和 PC12 细胞中 T-AOC、MDA 和 ROS 的变化Figure 3-2 Changes of T-AOC，MDA and ROS in fetal rat hippocampus and PC12 cells3.3 咪达唑仑减弱氯胺酮对胎鼠海马的影响本实验检测了胎鼠海马中自噬和凋亡相关蛋白的表达量，以及氧化应激的相关指标。通过结果分析发现，K+M 组与 K 组相比，c-caspase-3、Beclin-1、Bax、ATG5 和 LC3-II 分别下调了 22.3%、33.9%、56%、51%和 31.3%；而 Bcl-2、ATG4、和 P62 上调了 72.9%、71.1%、和 65.8%（见图 3-1）。在氧化应激方面，本实验检测了 T-AOC、ROS 和 MDA 的含量，发现，K+M 组与 K 组相比，T-AOC 发生上升，为 2.16±0.029 U/mgprot；而 ROS 和 MDA 的含量下降，分别为 4383.33±102.74（DCF Flurescenxe）和 1.33±0.042 nmol/mgprot（见图 3-2）。3.4 氯胺酮和咪达唑仑和过氧化氢对 PC12 细胞的最佳药物作用浓度的确定本实验应用 PC12 细胞进行了离体验证。应用 CCK-8 试剂盒来检测氯胺酮，咪达唑仑和过氧化氢对 PC12 细胞的最佳药物作用浓度。结果显示，当氯胺酮和过氧化氢浓度分别为 0.6
【参考文献】
本文编号：2838233
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S859.7
【部分图文】：
管理和样品收集怀孕的雌性大鼠随机分为以下 4 组（每组 n = 6）：对照组（C），氯胺酮M），氯胺酮和咪达唑仑联合组（K + M）。在 G19（相当于人类怀孕]时，让 C 组大鼠在笼中不受干扰；K 组大鼠通过肌肉注射氯胺酮（上买）（先按剂量为 80 mg/kg 进行肌肉注射，随后每隔 1 h 按剂量为 40 以保证氯胺酮稳定的血药浓度）；M 组大鼠通过肌肉注射咪达唑仑（，中国江苏）（剂量为 60 mg/kg）；K + M 组大鼠在通过肌肉注射氯胺 进行肌肉注射，随后每隔 1 h 按剂量为 40 mg/kg 进行补液三次）前 30 剂量为 60 mg/kg），氯胺酮的总体积小于 2 mL/100 g 体重，一共药物持这种输注方式诱导大鼠处于轻度麻醉和深度镇静之间的镇静状态，但不过翻正反射消失、肌肉紧张度减少和对疼痛的最小反应来确认是否达，通过断头方式来处死大鼠，并回收胎儿，剥离脑壳，将整个脑组织放皮层并收集海马组织（海马位置示意图如图 2-1）。海马组织收集后应存。本实验使用来自 3 个母鼠（3 个胎鼠/母鼠）的 9 只胎鼠。将取自胎儿的海马组织混合在一起，提取蛋白，将此混合的海马组织作为一一个数据。
果胺酮和咪达唑仑对胎鼠海马中自噬和凋亡相关蛋白表达施用氯胺酮后，LC3II、ATG5、Beclin-1、c-caspase-3 和 Bax 分别上调了 83.5%、132.844%和 104.9%，而 ATG4，自噬底物 P62 蛋白——P62（SQSTM1）和 Bcl-2 分别%、38.9%和 56.1%（见图 3-1）。M 组与 C 组相比，可以发现，没有明显的趋势变了更好的表达 LC3-I 与 LC3-II 和 Bax 与 Bcl-2 之间的转换，本实验做了 LC3-I/LC/Bcl-2 的比值柱状图。通过分析发现，K 组与 C 组相比，LC3-I/LC3-II 的比值发 Bax/Bcl-2 的比值变高（P<0.05，见图 3-1）；同时 M 组相对于 C 组无明显变化。
图 3-2 胎鼠海马和 PC12 细胞中 T-AOC、MDA 和 ROS 的变化Figure 3-2 Changes of T-AOC，MDA and ROS in fetal rat hippocampus and PC12 cells3.3 咪达唑仑减弱氯胺酮对胎鼠海马的影响本实验检测了胎鼠海马中自噬和凋亡相关蛋白的表达量，以及氧化应激的相关指标。通过结果分析发现，K+M 组与 K 组相比，c-caspase-3、Beclin-1、Bax、ATG5 和 LC3-II 分别下调了 22.3%、33.9%、56%、51%和 31.3%；而 Bcl-2、ATG4、和 P62 上调了 72.9%、71.1%、和 65.8%（见图 3-1）。在氧化应激方面，本实验检测了 T-AOC、ROS 和 MDA 的含量，发现，K+M 组与 K 组相比，T-AOC 发生上升，为 2.16±0.029 U/mgprot；而 ROS 和 MDA 的含量下降，分别为 4383.33±102.74（DCF Flurescenxe）和 1.33±0.042 nmol/mgprot（见图 3-2）。3.4 氯胺酮和咪达唑仑和过氧化氢对 PC12 细胞的最佳药物作用浓度的确定本实验应用 PC12 细胞进行了离体验证。应用 CCK-8 试剂盒来检测氯胺酮，咪达唑仑和过氧化氢对 PC12 细胞的最佳药物作用浓度。结果显示，当氯胺酮和过氧化氢浓度分别为 0.6
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 黄陈平;林林;宋明芬;方周溪;;氯胺酮对大鼠学习记忆功能及海马神经元的影响[J];毒理学杂志;2007年03期
2 郭忠英;咪达唑仑、氯胺酮合剂在小儿外科手术中的应用[J];实用儿科临床杂志;2003年05期
相关硕士学位论文 前1条
1 赵天云;孕中期大鼠母体氨胺酮麻醉致子鼠海马发育异常及情绪障碍[D];南方医科大学;2014年
本文编号：2838233
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