活化Nrf2上调HO-1表达抑制C57小鼠深静脉血栓形成的研究

发布时间：2020-11-18 10:47

　　 深静脉血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)是指血液在静脉内发生不正常凝结,完全或不完全阻塞血管,属于静脉回流障碍性疾病。DVT发病机制复杂,涉及凝血/抗凝系统、静脉内皮细胞、血小板、白细胞等多系统多因子的参与。近年研究认为,氧化应激反应产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)可导致血管静脉内皮细胞氧化损伤甚至凋亡,进而促进DVT的形成。研究发现,Nrf2/HO-1信号通路具有强烈的抗氧化作用,可保护血管内皮细胞免受或减轻氧化损伤,该通路被认为是目前抗氧化作用最强的通路。然而,该信号通路在DVT的形成过程中是否起作用尚未见报到。因此,本课题主要探讨:Nrf2/HO-1信号通路在小鼠DVT形成中的作用。①下腔静脉狭窄法构建C57小鼠DVT模型,观察Nrf2激动剂和HO-1抑制剂对小鼠成栓的影响;②检测各组C57小鼠静脉壁组织中Nrf2及HO-1基因的mRNA表达变化。旨在为找到防治DVT形成的关键靶点提供新的理论依据。[目的]1.采用小动物麻醉机吸入麻醉(异氟烷)以及下腔静脉狭窄法构建C57小鼠DVT模型;利用Nrf2的激动剂(TBHQ)及HO-1抑制剂(SnPP)干预C57小鼠DVT模型,造模后24小时观察各组小鼠DVT模型的死亡率、成栓率,下腔静脉血栓长度、湿重的变化差异。探究Nrf2/HO-1信号通路与DVT形成的关系。2.获取各组C57小鼠下腔静脉壁组织,并采用实时荧光定量PCR(real-time-PCR)检测各组C57小鼠静脉壁组织中Nrf2和HO-1基因的mRNA表达变化,探寻Nrf2/HO-1信号通路在DVT形成中的作用。[材料与方法]第一部分:下腔静脉狭窄法构建C57小鼠DVT模型观察Nrf2激动剂和HO-1抑制剂对小鼠成栓的影响1.实验分组及DVT模型的构建:C57小鼠90只,体重25-30g,雌性。按随机分组原则分为空白对照组10只(A组,n=10),DVT模型组20只(B组,n=20),Nrf2 激动剂(TBHQ)DVT 模型组(C 组,n=20),Nrf2 激动剂(TBHQ)、HO-1 抑制剂(SnPP)DVT 模型组(D 组,n=20),HO-1 抑制剂(SnPP)DVT 模型组(E组,n=20)。在实验造模前3天,C组小鼠每8小时腹腔注射TBHQ(16.7mg/kg)Y一次,共注射3天;D组小鼠在C组小鼠给药的基础上于造模前一天给予SnPP(5mg/kg),共注射一次;E组小鼠在造模前一天给予SnPP(5mg/kg),共注射一次;B、C、D、E四组小鼠均采用异氟烷吸入麻醉配合下腔静脉狭窄法构建DVT模型。2.取材及检测:实验造模24小时后,选择颈椎脱臼法处死实验小鼠,获取C57小鼠下腔静脉组织(从结扎部位至髂总静脉连接处取下腔静脉及其内容物),然后分离其静脉壁及其内的血栓,测量各小鼠血栓长度、湿重后分装-80°保存备用。3.统计学分析:对每组小鼠的死亡率、成栓率、血栓长度和湿重情况进行统计分析。统计学软件采用SPSS19.0,计量资料选用均数±标准差(x ± s);组间两两比较均利用单因素方差分析、用最小二乘法(LSD法),*p0.05有统计学意义。第二部分:各组C57小鼠静脉壁组织中Nrf2及HO-1的mRNA表达变化1.Trizol法提取每组小鼠剩余标本下腔静脉组织中总RNA,逆转录PCR法(RT-PCR法)将各组小鼠静脉组织RNA逆转录为cDNA;以GAPDH为内参照,用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠静脉壁中Nrf2和HO-1的mRNA表达变化;2.统计学分析:统计学软件选择SPSS19.0。计量资料选择均数±标准差(x± s);组间两两比较采用单因素方差分析,LSD(最小二乘法),*p0.05差异有统计学意义。[结果]实验一:下腔静脉狭窄法构建C57小鼠DVT模型观察Nrf2激动剂和HO-1抑制剂对小鼠成栓的影响1.麻醉效果:实验开始使用4%浓度异氟烷进行快速诱导,术中使用1.0%浓度异氟烷维持,麻醉效果理想。术后麻醉清醒时间较快,约2min,麻醉过程中个别小鼠会出现呼吸抑制,在关闭麻醉并加大空气流量后,其呼吸抑制情况得到迅速缓解。2.各组小鼠死亡情况:A、B、C组小鼠死亡率为0%,D、E组小鼠死亡率分别是10%、5%,B组与A、C组之间统计分析(*p0.05),差异无统计学意义。3.各组小鼠成栓率:A组小鼠成栓率为0%,B、C、D、E组总成栓率分别为68.4%、55.6%、63.2%、70%,C组与B、D组之间做统计分析(单因素方差分析)(*p0.05),差异有统计学意义。4.各组小鼠血栓长度:A组小鼠未成栓,B、C、D、E模型组血栓长度分别为:5.47±0.32mm、4.13±0.27mm、5.46±0.28mm、5.42±0.31m。C组与B、D组之间做统计分析(单因素方差分析)(*p0.05),差异有统计学意义。5.各组小鼠血栓湿重:A组小鼠未成栓,B、C、D、E模型组血栓湿重分别为:12.6±3.1mg、8.4±3.2mg、11.5±3.5mg、12.3±3.3mg。C 组与 B、D 组之间做统计分析(单因素方差分析)(*p0.05),差异有统计学意义。实验二:各组C57小鼠静脉壁组织中Nrf2及HO-1的mRNA表达变化实时定量PCR检测各组小鼠Nrf2、HO-1基因的mRNA的相对表达量。统计学分析结果后得出,DVT造模后24小时,A、B、C各组小鼠Nrf2、HO-1基因的mRNA表达量两两比较均存在显著统计学差异(*p0.05);C模型组小鼠Nrf2及HO-1的mRNA表达均高于A、B两组(*p0.05),B模型组小鼠Nrf2及HO-1的mRNA表达高于A组(*p0.05);D、E模型组小鼠HO-1的mRNA表达比较存在显著统计学差异(*p0.05),C模型组小鼠HO-1的mRNA表达高于D组(*p0.05)。[结论]1.活化Nrf2可抑制C57小鼠下腔静脉DVT的形成;2.活化Nrf2可能作用于HO-1进而抑制C57小鼠下腔静脉血栓的形成;
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R543.6
【部分图文】：

Ｄ、Ｅ两组血栓长度与Ｂ组接近，略小于Ｂ组。Ｃ组与Ｂ、Ｄ组之间做统??计分析（单因素方差分析）（＊Ｐ＜〇．?０５），差异有统计学意义。统计各组小鼠血??栓长度变化并进行平均值的比较，结果如表３及图１所示。??表３小鼠血栓长度（Ｘ?土Ｓ）、Ｆ值。（单位：麵）??Ｔａｂｌｅ?３?Ｌｅｎｇｔｈ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｔｈｒｏｍｂｕｓ?（?Ｘ?土Ｓ?）?（Ｕｎｉｔ：?ｍｍ）??ｍｉ?ｎ?ｂＥ?ｃＨ?ｄＨ?ｅＨ??￣血栓长度?０?５．４７?＋?０．３２＊￣４．?１３土０．２７￣５．?４６?＋?０．２８＊￣５．?４２?＋?０．３１??Ｆ?值?１２１．３??注：＊表示与Ｃ组比较Ｐ＜０．?０５??６－，?Ｉ￣＾－＼?Ｉ—??ｌ?ｌ?ｌ?ｌ??占?ＵＩＩＩ??图１各组小鼠血栓长度（注：＊：Ｐ〈０．０５）??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｌｅｎｇｔｈ?ｏｆ?ｍｏｕｓｅ?ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ?ｉｎ?ｅａｃｈ?ｇｒｏｕｐ?（Ｎｏｔｅ：?＊：?Ｐ?＜０．０５）??１８??

型组（ＤＶＴ组）的平均血栓湿重最大，Ｄ、Ｅ两组血栓湿重与Ｂ组接近，略小于Ｂ??组。Ｃ组与Ｂ、Ｄ组之间做统计分析（单因素方差分析）（＊ｐ〈〇．?〇５），差异有统??计学意义。统计各组小鼠血栓湿重变化并进行平均值的比较，结果如表４及图２??所示。??表４小鼠鼠血栓湿重（Ｘ?土Ｓ）、Ｆ值。（单位：ｍｇ）?（＊ｐ＜０．０５）??Ｔａｂｌｅ?４?Ｗｅｔ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ｒａｆｓ?ｔｈｒｏｍｂｕｓ?（?Ｘ±Ｓ）?（Ｕｎｉｔ：?ｍｇ）?（＊ｐ＜０．０５）??组别?Ｈｉ?ｂＨ?ｃｍ．?ｄｍ?ｅＨ??血栓湿重?〇?１２．６?＋?３．?１＊?８．４±３．２?１１．５?＋?３．５＊?１２．３?＋?３．３￣??Ｆ?值?９．６１０??１５￣｜?Ｉ—Ｉ?ｌ－＾Ｈ??ＯｉＵ??图２小鼠鼠各组血栓湿重（注：＊：ｐ〈０．?０５）??Ｆｉｇｕｒｅ?２?Ｗｅｔ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ｍｏｕｓｅｄ?ｔｈｒｏｍｂｕｓ（Ｎｏｔｅ：?＊：?Ｐ?＜０．０５）??１９??
【参考文献】

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1 董渠龙;王华;侯海燕;陈亚琼;;Nrf2-ARE信号通路功能的研究进展[J];国际妇产科学杂志;2015年04期

2 白云城;赵学凌;周如丹;周志化;吴雪梅;王兵;;大鼠下腔静脉血栓模型的建立及手术技巧[J];南京医科大学学报(自然科学版);2014年03期

3 马洁;王倩倩;廖虹;杨永彬;金志军;张箴波;祝亚平;丰有吉;;促卵泡激素通过活性氧途径调控卵巢癌细胞Nrf2蛋白的表达[J];第二军医大学学报;2012年09期

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本文编号：2888635