二苯乙烯苷对糖尿病肾病的作用及初步机制研究

发布时间：2017-04-08 09:23

  本文关键词：二苯乙烯苷对糖尿病肾病的作用及初步机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:糖尿病有多种并发症,糖尿病肾病(Diabetiene Phro Pathy,DN)是其中最常见的一种,也是患者的重要死亡原因。由于2型糖尿病的起病比较隐匿,大多数患者往往不能及时发现,据数据统计,有5%的患者在诊断糖尿病时就发现已经伴有DN的肾脏损伤。而且,当患者在临床上表现出相关症状时,其死亡率明显增加,而且治疗十分困难。因此,DN也就成为了当今世界糖尿病领域研究的热点和难点。随着DN的发病率不断升高和社会人口的老龄化,这个数据还会不断升高。另有研究表明,在这些终末期的肾脏疾病患者中,约有40%是由DN导致的,每年新增终末期肾病患者中由DN引发的高达50%以上。我国DN的发生率约为34.7%,已成为慢性肾功能衰竭的主要原因,其危害不容忽视。DN的病理机制是一个动态的发展过程,整个疾病的病程长,并且有大量的研究成果表明DN是多种因素作用的结果,在临床治疗上存在一定的困难。DN的临床表现变化复杂,欠期甚至没有临床症状,晚期可导致终末期肾病的谢紊乱。目前,治疗DN的的方法大都是健康疗法,并且以预防为主,对其病机不同学者观点有所差异,各有侧重。其中,中药防治DN作用机制的实验研究受到广泛关注。为了更好且有效地解决这一难题,进一步深入研究其意义深远。所以,我们通过进一步的深化研究中药对DN的作用机制,为阐明DN的发病机制,筛选出有效的药物进行深化的研究以及提出科学的依据。DN的发病机制尚未完全阐明。现今实验研究结果表明,DN与糖脂代谢紊乱,氧化应激反应,血管活性物质,血流动力学改变等多种因素有关,从而引起慢性肾脏损伤。随着人们对氧化应激反应在DN发病机制中的重要性的深入研究,氧化应激反应在对DN的研究越来越受到重视,而抗氧化也成了治疗DN的新靶点和新热点。二苯乙烯苷(TSG)是我国传统中药何首乌中提取的一种具有显著药理活性的水溶性成分。目前,大量文献和研究成果表明,TSG在治疗多种疾病时都参与了氧化应激反应,且具有抗衰老、抗炎、抗菌、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用,但是否对DN具有良好的治疗效果尚未见文献报道。据此,我们提出假说:TSG可能通过调节动物体内的氧化应激水平,提高机体的抗氧化性,从而达到治疗DN的目的。为证实此假说,本课题拟采用雄性大鼠和大鼠肾小球系膜细胞模型探讨TSG对链脲佐菌素诱导的DN大以及高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞的氧化应激作用及其机制。方法:1动物模型的制作与用药选取体重为250g-280g的SD大鼠作为实验对象,所有动物均采用普通大鼠专用饲料喂养,随意饮水,摄食,室温控制在25℃左右,湿度70%,12小时交替照明。将60只大鼠随机分为正常对照组10只、DN模型组50只。大鼠实验前禁食12小时(不禁水),将链脲佐菌素溶于p H4.4柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中,按50mg/kg一次性腹腔内注射,3天后检测动物的血糖浓度大于16.7mmol/L,尿糖阳性,确定为糖尿病成型;动物继续糖尿病成模4周后,使用尿液分析仪检测尿液生化指标,尿蛋白明显增加,说明DN模型成功。选取造模成功大鼠按照体重区段随机分为5组,分别为模型组(生理盐水5m L/kg,2次/天,ip.),厄贝沙坦(厄贝沙坦片,6mg/kg,ip.),TSG低剂量组(20mg/kg,ip.),TSG中剂量组(40mg/kg,2次/天,ip.),TSG高剂量组(60mg/kg,2次/天,ip.)。2 DN大鼠血和尿生化指标的检测分别在给药后第2、4、6周,用取血针从尾部取血检测血糖;分别在给药后第2、4、6周,大鼠麻醉,眼眶取血1.5m L,离心取上层血清;实验结束前,通过腹腔取血的方法收集血液并离心取上层血清。使用全自动生化分析仪测定血清中高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,糖化血清蛋白,血尿素氮,血肌酐等的表达水平;用比色法检测试尿中总蛋白的含量。3大鼠肾小球系膜细胞的培养及周期和凋亡的检测将冻存的细胞快速放入37℃的水浴中,轻摇冻存管,使其在一分钟内全部融化,将融化的细胞离心后弃上清,加入含10%FBS和双抗的高糖培养基反复吹打,通过显微镜观察,当细胞均匀的悬浮在培养基中进行细胞传代,并观察其细胞形态,将生长状态良好的细胞培养在96孔培养板中,待细胞帖壁后,向培养板中加入不同浓度的TSG,采用MTT进行细胞增殖分析;采用流式细胞仪检测在不同浓度的药物干预下,大鼠肾小球系膜细胞的周期变化和凋亡变化。4 TSG对DN大鼠血清中氧化应激指标的检测DN大鼠的血液通过离心后取血清;采用氧化应激指标试剂盒,通过全自动生化仪进行分析,测定出不同浓度的TSG对DN大鼠血清中NO、NOS、MDA、SOD等指标的影响;在通RT-PCR及Western blot方法检测血清中相关蛋白的表达。5 TSG对DN大鼠组织中抗氧化酶基因HO-1,γ-GCS表达蛋白表达的影响给药8周后,取出处死大鼠的肾脏,称重,检测不同组大鼠的肾重系数;将称重过的组织部分进行匀浆,通过Western blot法检测不同给药浓度肾脏组织中抗氧化酶基因HO-1,γ-GCS表达等蛋白的表达。结果:1 TSG能够明显改善DN大鼠的肾脏损伤通过DN大鼠的血清生化指标结果显示,模型组大鼠与正常组大鼠相比,血糖明显升高,血清中各项指标明显异常,出现三多一少症状,死亡率升高,通过对模型组大鼠进行TSG药物干预,发现TSG可以明显降低DN大鼠血糖,改善模型组大鼠血生化指标异常,降低死亡率;通过称量大鼠的体重和肾脏重量,发现TSG可以明显降低DN大鼠的肾重系数;在细胞实验中,通过MTT结果和流式细胞术结果我们不难发现,TSG可以改变高糖环境下肾小球系膜细胞的周期和凋亡,减少高糖对细胞的损伤。2 TSG改善体内及细胞的氧化应激反应氧化应激试剂盒、RT-PCR和Western Blot的检测结果证实TSG确实可以调节体内的氧化应激反应。实验结果显示,TSG可以明显的改善动物血清和细胞上清中氧化应激指标。3 TSG对DN大鼠的肾组织及肾小球系膜细胞凋亡的保护通过Western blot法检测不同给药浓度肾脏组织中和细胞上清中Nrf2蛋白的表达,发现各组大鼠肾组织和细胞上清中均有表达,其中DN组的蛋白表达明显高于其他组;通过电镜观察,发现DN组大鼠的肾组织细胞中有大量的系膜细胞核内染色质向边缘靠拢,聚集成团等细胞凋亡现象,而在TSG干预后,这种凋亡现象有明显好转。结论:TSG能够有效降低DN大鼠血糖,抑制DN大鼠肾小球系膜细胞增生,改善血清中各项生化指标,对DN大鼠肾脏具有保护作用。Nrf2蛋白通路参与了DN肾脏组织中细胞的凋亡,TSG通过抑制Nrf2通路蛋白发挥其对DN大鼠肾组织的保护作用。TSG可以明显的改善DN大鼠和大鼠肾小球系膜细胞内的氧化应激反应,从而达到对DN大鼠肾组织损伤的保护。
【关键词】：糖尿病肾病 二苯乙烯苷 氧化应激 大鼠 机制
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-16
• 文献回顾16-25
• 1 TSG 药理研究进展16-19
• 2 DN 研究进展19-22
• 3 氧化应激反应研究进展22-23
• 4 DN 动物模型23-25
• 第一部分 TSG对STZ诱导的DN大鼠的药效学研究25-38
• 1 实验材料25-27
• 2 方法27-33
• 3 实验结果33-37
• 4 讨论37-38
• 第二部分 TSG对DN大鼠氧化应激反应相关因子的影响38-50
• 1 实验材料38-41
• 2 实验方法41-45
• 3 实验结果45-49
• 4 讨论49-50
• 第三部分 TSG对高糖培养的肾小球系膜细胞抑制增殖和促凋亡作用50-57
• 1 实验材料50-51
• 2 实验方法51-54
• 3 实验结果54-56
• 4 讨论56-57
• 第四部分 TSG对高糖培养的肾小球系膜细胞的抗氧化应激反应的影响57-63
• 1 实验材料57-58
• 2 方法58-59
• 3 实验结果59-62
• 4 讨论62-63
• 全文小结63-64
• 参考文献64-73
• 个人简历和研究成果73-74
• 致谢74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 孙江浩,张兰桐,王春英,袁志芳,卢兴红;液-质联用法测定小鼠体内二苯乙烯苷代谢物[J];药学学报;2003年12期

2 胡存华;赵立波;王晓敏;王嘉陵;;二苯乙烯苷增强正常血管内皮细胞抗氧化作用研究[J];医药导报;2007年02期

3 王春英;李敏;袁志芳;杨维;解凤立;张兰桐;;二苯乙烯苷大鼠在体胃肠吸收动力学研究[J];中草药;2008年08期

4 白研,葛发欢,史庆龙,黄丽玫,陈红红;超临界CO_2流体萃取制首乌中的有效成分[J];中药材;2005年04期

5 肖祥;李贵森;;糖尿病肾病模型及研究新进展[J];实用医院临床杂志;2013年03期

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本文编号：292579