丙烯腈对大鼠内源性硫化氢代谢的影响及其机制研究

发布时间：2017-04-14 09:24

  本文关键词：丙烯腈对大鼠内源性硫化氢代谢的影响及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:丙烯腈(acrylonitrile,AN)是有机合成工业的重要产品和原料,广泛应用于腈纶、丁腈橡胶、纤维、树脂的合成等。近年来由于相关产业迅速发展,职业和生活接触机会明显增多。为保护接触人群健康,国内外学者对其毒性特别是急性毒性进行了积极探索,但AN急性中毒机理尚不明确。在机体代谢过程中发现AN会与含巯基的蛋白或化合物结合,从而消耗巯基,而巯基是机体合成硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)所必须的。H2S作为最新发现的内源性气体信号分子,具有重要的生物学功能,广泛参与机体的多种生理和病理过程,已有研究表明H2S也参与一些环境、职业化学物及药物的毒性作用,同时外源性H2S对化学物毒性有拮抗作用。本研究旨在通过构建AN急性中毒的动物模型,探讨:1.AN对大鼠内源性H2S代谢影响的时间剂量效应关系;2.AN代谢的关键酶细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)的抑制剂反式-1,2-二氯乙烯(trans-1,2-dichlorethylene,DCE)和诱导剂丙酮预处理调节CYP2E1活性探索AN影响H2S代谢变化的潜在机制;根据以上研究内容进一步明确AN急性致毒机制,为AN急性中毒的预防与治疗提供新的靶点。方法:实验1:雄性SD大鼠60只,随机分为空白对照组(生理盐水)、25 mg/kg AN组、50 mg/kg AN组、75 mg/kg AN组。AN染毒采用腹腔注射,对照组和三个染毒组分别于染毒后1 h、6 h、24 h随机取5只大鼠,麻醉后断头处死,取肝脏和大脑皮层。实验2:48只雄性SD大鼠,随机分为4组:空白对照组(生理盐水)、单纯AN染毒组、单纯反式-1,2-二氯乙烯(DCE)组、DCE预处理+AN染毒组(DCE+AN)。对照组给予腹腔注射生理盐水,染毒采用腹腔注射50 mg/kg AN,预处理组腹腔注射100 mg/kg DCE,2.5 h后再腹腔注射50 mg/kg AN。所有染毒组分别于AN染毒后1 h、6 h、24 h随即取6只大鼠,麻醉后断头处死,取肝脏和大脑皮层。实验3:48只雄性SD大鼠,随机分为4组,分别为空白对照组(生理盐水)、单纯AN染毒组、单纯丙酮组、丙酮预处理+AN染毒组(丙酮+AN)。对照组给予生理盐水(腹腔注射),染毒采用腹腔注射50 mg/kg AN,丙酮预处理组预先饲喂1%丙酮饮水一周再腹腔注射50 mg/kg AN。所有染毒组分别于AN染毒后1 h、6 h、24 h随机取6只大鼠,麻醉后断头处死,取肝脏和大脑皮层。观察AN染毒后大鼠的行为变化;采用亚甲基蓝分光光度计法检测肝脏和大脑皮层中内源性H2S含量和H2S生成酶的活性;蛋白免疫印迹法检测肝脏和大脑皮层中H2S生成酶蛋白包括胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)和3-巯基丙酮酸转硫酶(3-merecaptopyruvate sulfurtransferase,3-MPST)的表达情况。实验1中测定了氧化应激标志物:还原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)含量;实验2和3检测了肝脏微粒体CYP2E1酶活性和CYP2E1蛋白表达。结果:实验1:AN染毒组大鼠均出现不同程度的流汗、流涎、耳廓发红等症状,50 mg/kg和75 mg/kg AN剂量组个别大鼠有抽搐、呼吸困难等症状;与空白对照组相比,AN染毒组大鼠肝脏和大脑皮层中内源性H2S含量和H2S生成酶活性显著降低,并具有剂量时间依赖关系;蛋白印迹结果显示不同剂量AN染毒组肝脏中CBS、CSE、3-MPST蛋白表达显著性下降(p0.05),大脑皮层中CBS、3-MPST蛋白含量也显著下降(CSE蛋白在大脑皮层中不表达);氧化应激标志物结果显示,染毒组GSH水平显著低于空白对照组(p0.05),MDA和ROS显著升高,并呈时间剂量依赖关系。实验2:所有AN染毒组均出现流汗、流涎、耳廓发红等症状;DCE可显著抑制CYP2E1蛋白表达与酶活性(p0.05);与单纯AN组相比,DCE+AN组大鼠肝脏和大脑皮层内源性H2S含量在24 h时显著升高(p0.05);DCE+AN组肝脏中H2S生成酶活性与单纯AN组相比升高,在24 h具有统计学意义(p0.05);大脑皮层中H2S生成酶活性在6 h,24 h显著性升高。实验3:丙酮+AN组大鼠出现抽搐、角弓反张、尾巴僵直等症状,并在AN染毒8h有5只大鼠相继死亡;丙酮可显著诱导CYP2E1蛋白表达与酶活性(p0.05);丙酮+AN组肝脏和脑皮层中内源性H2S含量和硫化氢生成酶活性与单纯AN组相比变化无显著性差异;丙酮+AN组肝脏和脑皮层中CBS、3-MPST蛋白表达与单纯AN组相比有所下降,在6 h有统计学意义(p0.05),而肝脏中CSE蛋白表达也下降,但没有显著性差异。结论:AN显著抑制内源性H2S代谢;抑制CYP2E1活性能促进AN染毒大鼠内源性H2S代谢,而CYP2E1上调抑制其代谢;内源性H2S参与AN急性毒性这可能是AN急性毒性的新机制。
【关键词】：丙烯腈 硫化氢 CYP2E1 CBS CSE 3-MPST
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 英文缩写索引14-15
• 第一章 绪论15-25
• 1.1 丙烯腈15-17
• 1.1.1 丙烯腈理化性质及用途15
• 1.1.2 丙烯腈接触机会与接触途径15
• 1.1.3 丙烯腈代谢途径15-16
• 1.1.4 丙烯腈毒性16-17
• 1.1.5 细胞色素P4502E117
• 1.2 丙烯腈与硫化氢17-18
• 1.3 硫化氢18-23
• 1.3.1 硫化氢概述18-19
• 1.3.2 内源性硫化氢生成、代谢与调节19-21
• 1.3.3 硫化氢测定21-22
• 1.3.4 内源性硫化氢生理作用22-23
• 1.4 研究内容23-25
• 1.4.1 研究目的和意义23
• 1.4.2 实验设计思路23-24
• 1.4.3 技术路线24-25
• 第二章 丙烯腈对大鼠内源性硫化氢代谢影响的时间剂量效应关系研究25-45
• 2.1.实验材料25-29
• 2.1.1 实验动物25
• 2.1.2 实验仪器25-26
• 2.1.3 实验试剂26-27
• 2.1.4 主要试剂配制27-29
• 2.2 实验方法29-34
• 2.2.1 动物处理29
• 2.2.2 组织匀浆制备29-30
• 2.2.3 肝脏和大脑皮层中硫化氢含量测定30
• 2.2.4 肝脏和大脑皮层中硫化氢合成酶活性检测30-31
• 2.2.5 组织蛋白质提取31
• 2.2.6 蛋白质定量31-32
• 2.2.7 Western Blotting32-33
• 2.2.8 肝脏和大脑皮层组织中还原性GSH含量测定33-34
• 2.2.9 肝脏和大脑皮层组织中MDA含量测定34
• 2.2.10 肝脏和大脑皮层组织中ROS含量测定34
• 2.3 数据分析34
• 2.4 实验结果34-41
• 2.4.1 急性AN染毒对大鼠行为影响34-35
• 2.4.2 AN对大鼠肝脏和大脑皮层中内源性H2S含量的影响35-36
• 2.4.3 AN对大鼠肝脏和大脑皮层中内源性H2S生成酶活性的影响36-37
• 2.4.4 AN对大鼠肝脏H2S生成酶蛋白表达的影响37-38
• 2.4.5 AN对大鼠大脑皮层H2S生成酶蛋白表达的影响38-39
• 2.4.6 AN对大鼠肝脏和大脑皮层还原性GSH含量的影响39-40
• 2.4.7 AN对大鼠肝脏和大脑皮层MDA含量的影响40
• 2.4.8 AN对大鼠肝脏和大脑皮层ROS含量的影响40-41
• 2.5 讨论41-45
• 第三章 CYP 2E1活性调控对丙烯腈染毒大鼠内源性硫化氢代谢的影响45-58
• 3.1.实验材料45-46
• 3.1.1 实验动物45
• 3.1.2 实验仪器45
• 3.1.3 实验试剂45-46
• 3.2 实验方法46-47
• 3.2.1 制备肝微粒体46
• 3.2.2 BCA法测定蛋白浓度46
• 3.2.3 肝CYP 2E1活性测定46-47
• 3.2.4 肝脏和大脑皮层中硫化氢含量测定47
• 3.2.5 肝脏和大脑皮层中硫化氢生成酶活性含量测定47
• 3.2.6 Western Blotting47
• 3.3 数据分析47
• 3.4 结果47-55
• 3.4.1 CYP 2E1抑制剂预处理对AN染毒大鼠内源性H2S代谢的影响47-51
• 3.4.2 CYP 2E1诱导剂预处理对AN染毒大鼠内源性H2S代谢的影响51-55
• 3.5 讨论55-58
• 第四章 结论与展望58-59
• 参考文献59-68
• 致谢68-69
• 攻读硕士期间发表的学术论文及参加的学术会议69-70

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