细胞因子网络失衡与外燥伤肺病机的实验研究

发布时间：2017-04-14 17:15

  本文关键词：细胞因子网络失衡与外燥伤肺病机的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：肺吸入自然界之清气且散纳有度,气道洁净则贵在流通宣畅。与现代医学中的小血管、微血管包括微循环高度相关的丰富肺络脉是“肺司呼吸”功能的物质基础。气体与肺毛细血管血液之间进行气体交换所通过的六层厚约0.2 μm-1μm的组织结构称为呼吸膜(respiratory membrane, RM),其扩散速率与RM厚度呈反比。精细的解剖学知识与生理学机制将为呼吸膜与“肺司呼吸”理论在微观结构层次、体内外气体交换功能和多以喘咳主症的相似性提供生理、生化、病理等客观标准与参照系,成为沟通人类证候与模型动物证候的桥梁。外燥伤肺的病机实质涉及外邪与机体微观物质如促炎细胞因子／抗炎细胞因子、水液代谢相关基因表达的平衡紊乱。查新资料显示近20年未见相同研究报道。本学位论文课题以《内经》六淫外燥伤肺理论为指导,以前期相关研究为基础,结合微超病理学、免疫学、分子生物学理论与技术,以气道细胞因子网络平衡为切入点,研究促炎细胞因子／抗炎细胞因子平衡失调、AQP5基因表达异常,证实“气道细胞因子网络失衡导致肺部炎性病理改变是伤肺喘咳证候物质基础”的假说,根据研究结果阐析气道细胞因子网络失衡导致外燥伤肺喘咳病机的物质基础及病理生理学机制,为推进六淫伤肺喘咳共性物质基础研究提供实验依据,具有理论创新与临床指导意义。材料：一、实验动物：昆明种小鼠(SPF级,体重17±1g)132只,雌雄各半(湖北省实验动物中心提供,实验动物许可证号：鄂准字2008-2005)。小鼠经数字法随机分常温常湿组、温燥组、凉燥组,每组44只。二、主要仪器：LRH-250人工智能气候箱,温度(6-65℃)±1℃,相对湿度(30%-90%)±3%(广东医疗器械厂),MASTER-K30H风扇程控仪(韩国Best机电有限公司),HITACHI-7500透射电镜(日本),BioTek酶标仪(美国),荧光定量PCR系统(SLAN, HONGSHI,美国),扫描仪(V300, EPSON),徕卡普通与超薄切片机(德国),neofuge 15R冷冻离心机(heal force,中国香港),DYY-6c电泳仪(北京六一仪器厂),紫外分光光度计(752-P,上海现科仪器有限公司)。三、主要试剂：NE(批号201310)、al-AT (201310)、ET (20038)、PAF (20204)单克隆抗体试剂盒(IBL-America公司);IL-10(1201267)与TNF-a (1201262)单克隆抗体试剂盒(美国RD公司)。兔抗小鼠AQP5多克隆抗体试剂盒(DA0648,200902,武汉博士德生物技术有限公司),生物素化羊抗兔二抗、SABC试剂盒、DAB、L-多聚赖氨酸及阳性对照片均购于武汉博士德生物技术有限公司；Superscript Ⅱ逆转录试剂盒(FSK-100)与SYBR Green realtime PCR master mix-plus (QPK212 plus, TOYOBO公司)；抗体Actin (Sc-1616r)为美国pierce公司)；乙醚、甲醛(20090325,上海)、PBS均为分析纯。方法：132只昆明种小鼠经数字法随机分为常温常湿组、温燥组和凉燥组,每组44只,分批置人工气候箱内常规饲养,按文献综合条件刺激造模。各组小鼠在第6天、第12天检测以下项目；小鼠剖检前4h常规禁食、禁水。检测项目：一、肺组织病理学观察1.普通病理学观察：断颈处死小鼠,取小鼠右肺组织(中)40±1Omg/只,常规石腊切片、HE染色与光镜观察。2.超微结构观察：各组随机取4只小鼠经乙醚麻醉,经气管插管向肺内注入2%戊二醛1.0 ml固定1h后,取左肺中叶组织制成1cm × 1cm × 2cm组织块,常规切片、醋酸铀染色与透射电镜拍片；观察肺呼吸膜、肺间质超微结构,用JEDA 80ID图像软件(江苏捷达公司)分析呼吸膜平均厚度。二、促炎细胞因子/抗炎细胞因子水平检测各组经常规气管插管法取支气管肺灌洗液1.5 ml、置-82℃保存、7天内统一检测。用单克隆抗体ELISA试剂盒,按说明书操作,设空白对照、PBS阴性对照；BioTek酶免疫分析仪495 nm测定OD值,查标准品曲线计算待检标本含量。三、分子生物学检测(一)肺组织水通道蛋白5mRNA测定采用荧光实时PCR方法检测。检索NCBI(美国国家生物信息中心)查询基因序列,0ligo6软件设计扩增模板引物(上海生工生物技术公司),上游引物：5'-GGCTGCAATCCTCTACTTCTAC-3',下游引物：5'-TTCTTCCGCTCCTCTCTATGA-3'(127bp)；内参照基因β-肌动蛋白(β-actin)引物序列：上游引物：5'-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3',下游引物：5'-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3'(191bp)。 RT-PCR反应体系为50u1：目的cDNA4u1、Taq DNA聚合物2ul (1u/1ul)、12.5pmol的引物a、b各2ul、4×10nM dNTP 2u1;经95℃预变性、55℃退火、72℃延伸等40个循环。采用2-△△Ct方法计算AQP5 mRNA表达水平。(二)肺组织水通道蛋白5蛋白质表达水平检测常规Western blotting方法检测。主要操作步骤：提取总蛋白、BCA(bicinchoninic acid)法测定上清液中蛋白质含量、SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、化学发光,显影,定影、胶片扫描,alphaEaseFc图像分析软件进行密度分析并计算灰度值,所得结果为目的蛋白的相对含量。四、统计学方法：实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,显著性检验采用多个样本均数间q检验(Newman-Keuls法)：P0.05认为差异有统计学意义,检验水准为双侧a=0.05。结果：一、组织病理学观察(一)普通组织病理学观察再次显示,与常温常湿组第6、第12天肺组织结构无异常比较,温燥组、凉燥组肺泡片状瘀血、水肿与纤维素性渗出物,肺间质增厚与炎性细胞侵润,伴肺气肿现象,均以第12天为重。(二)超微结构观察1、常温常湿组第6、第12天肺呼吸膜清晰,毛细血管内皮细胞结构清晰；Ⅱ型肺泡细胞(AT ⅡI)与Ⅰ型肺泡细胞(AT Ⅰ)连接清晰,AT Ⅱ微绒毛丰富且规则排列于胞膜肺泡缘处；胞内嗜锇性板层小体(OMB)较多且分泌旺盛；线粒体数量丰富。温燥组、凉燥组AT ⅡI微绒毛减少,胞内线粒体数量减少,并多见肿胀为“条状面包状”线粒体；肺泡隔部增宽、呼吸膜增厚、毛细血管内皮细胞肿胀。2、常温常湿组第6天、第12天肺泡隔、AT Ⅰ与AT Ⅱ结构清晰,肺泡毛细血管与呼吸膜结构无异常,毛细血管结构清晰无肿胀；温燥组、凉燥组肺泡隔增宽伴胶原纤维增生,肺泡毛细血管内皮细胞肿胀,AT Ⅰ基膜肿胀、多不规则且多见点状断裂,AT Ⅰ基膜与毛细血管基膜组织间隙明显增宽。图像分析温燥组、凉燥组呼吸膜较常温常湿组明显增厚(p0.05)。二、气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子/抗炎细胞因子水平1.与常温常湿组NE与al-AT比较,温燥组与凉燥组第6、第12天NE升高,以凉燥组为重(p0.05)；两组al-AT下降,也以凉燥组为甚(p0.05)。2.常温常湿组TNF-a与IL-10,温燥组第12天、凉燥组第6与第12天TNF-a下降但无统计学意义；温燥组、凉燥组第6、第12天IL-10含量下降(p0.01)。3.与常温常湿组ET与PAF比较,温燥组第6、第12天ET升高但无统计学意义,凉燥组则变化不明显。温燥组、凉燥组第6、第12天PAF升高(p0.05)。三、AQP5 mRNA与蛋白质表达水平测定与常温常湿组比较,温燥组、凉燥组第6、第12天AQP5 m RNA表达下调(p0.01),以第12天为重(p0.01)；温燥组第6、第12天AQP5蛋白质表达水平持续下降,凉燥组则是先升后降(p0.01)。讨论：1.超微结构显示外燥损伤呼吸膜的病理特征是：AT Ⅰ基膜肿胀且不规则、毛细血管基底膜增厚与内皮细胞肿胀且部分呈剥脱状性呼吸膜增厚。首次图像量化分析显示温燥组、凉燥组呼吸膜较常温常湿组显著增厚(p0.05)。结合文献报道的外燥致AT Ⅱ线粒体肿胀表明AT Ⅱ能量代谢障碍、嗜锇板层小体减少提示ATⅡ合成肺表面活性物质的功能受损,而外燥致肺泡内壁水分子层的减少可影响表面活性物质在其上形成稳定的单分子磷脂层膜而致肺失濡养,必失有效调节肺泡表面张力之功并致肺泡通气功能障碍,提出呼吸膜增厚是外燥伤肺的特征性超微组织病理学基础和超微病理学指标。2.外燥引起AT Ⅱ合成与分泌肺泡表面活性物质减少,导致肺失濡润性肺泡超微结构受损后的某些成分作为“内源性危险信号”(Damage associated molecular patern, DAMP)激活单核／巨噬细胞肺内聚集并大量释放促炎细胞因子,导致促炎细胞因子／抗炎细胞因子网络平衡紊乱,启动以中性粒细胞释放蛋白酶和血小板活化因子为中心的失控性细胞因子级联反应,是外燥伤肺病机的分子生物学基础。3.促炎／抗炎细胞因子网络失衡引起AQP5基因表达下调及蛋白质水平下降提示肺泡液转运障碍；失控性炎症反应引起炎性介质瘀滞、肺毛细血管内皮细胞肿胀、血管通透性增高与液体渗出导致基膜组织间隙水肿性呼吸膜增厚,重则肺泡瘀血、水肿,导致O2和CO2的扩散速率和有效通气／血液比值下降而损“肺通天气”之功,成为解析外燥伤肺、气逆、喘咳诸症的病理生理学基础。4.结果显示外燥伤肺不同于“以TNF-a为主的炎性细胞因子‘瀑布效应’损伤肺络而致喘咳诸症的病理学基础”的报道,表明与外燥病邪致病特征相关。学位课题研究的创新点：1、首次提出Ⅰ型肺泡上皮细胞基膜肿胀、肺毛细血管内皮细胞肿胀与血管通透性增高及液体渗出导致基膜组织间隙水肿性呼吸膜增厚,是外燥伤肺的特征性超微组织病理学基础。2、首次提出以肺毛细血管为中心拍摄呼吸膜薄侧以量化测定呼吸膜平均厚度的方法。3、首次提出外燥引起AT Ⅱ合成与分泌肺泡表面活性物质减少,导致肺失濡润与肺泡超微结构受损后的某些成分作为“内源性危险信号”大量激活单核／巨噬细胞,引起促炎／抗炎细胞因子网络失衡,且下调肺水通道蛋白5基因表达与蛋白质水平,启动以中性粒细胞弹性蛋白酶和血小板活化因子为中心的失控性炎性细胞因子级联反应,通过肺泡水液转运失调、肺毛细血管内皮细胞肿胀、基膜组织间隙水肿等导致呼吸膜增厚而损“肺通天气”之功。提出促炎／抗炎细胞因子失衡与AQP5基因表达紊乱可作为解析外燥伤肺病机的分子病理生理学基础和特征性指标之一；丰富了外燥伤肺理论,具有理论创新与临床指导意义。
【关键词】：外燥 呼吸膜 细胞因子 水通道蛋白5基因
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R254.4
【目录】：

• 摘要4-9
• abstract9-16
• 缩写词表16-19
• 第1章 燥邪基础理论探析19-25
• 1.1 外燥病变特点与临床辨治19
• 1.2 细胞因子与呼吸膜损伤的相关研究概况19-23
• 1.3 水通道蛋白表达异常与肺部损伤23
• 1.4 相关研究的启示与提出科研假说23-24
• 1.5 研究的主要内容与意义24-25
• 第2章 外燥小鼠呼吸膜超微结构观察25-29
• 2.1 主要材料25
• 2.2 方法25-27
• 2.3 结果27-29
• 第3章 外燥对小鼠气道液细胞因子的影响29-33
• 3.1 主要材料29
• 3.2 方法29-30
• 3.3 结果30-33
• 第4章 外燥对肺组AQP5基因与蛋白质表达的影响33-38
• 4.1 主要材料33
• 4.2 方法33-37
• 4.3 结果37-38
• 第5章 讨论38-45
• 5.1 呼吸膜厚度测定方法的研究38-39
• 5.2 外燥对呼吸膜超微结构的影响与特征39-40
• 5.3 细胞因子网络失衡与外燥伤肺病机的相关性及意义40-43
• 5.4 学位课题研究的创新点43-44
• 5.5 对继续研究的建议44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-49
• 附一：呼吸膜与呼吸系统疾病研究进展49-56
• 个人简介56-57
• 长江大学医学伦理审查申请表57-58

【共引文献】

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本文编号：306476