二氢辣椒碱通过抑制Foxa2和增强LXRα下调HepG2中apoM的表达

发布时间：2017-05-05 13:16

  本文关键词：二氢辣椒碱通过抑制Foxa2和增强LXRα下调HepG2中apoM的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景二氢辣椒碱(dihydrocapsaicin, DHC)和辣椒素(capsaicin)占红辣椒提取物中辣椒素类物质的85-90%。已证实DHC可以加速人和啮齿类动物碳水化合物代谢、能量消耗和脂质代谢,且已成功用于治疗和缓解一些临床症状,如周围神经炎引起的疼痛、类风湿性关节炎和骨关节炎等。有研究表明定期摄入红辣椒可以在体外增加脂蛋白的抗氧化能力和在体内调节餐后高胰岛素血症等情况,这些机体的变化提示DHC可能有助于降低心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)的风险。Adam等研究发现DHC和capsaicin可以在体外抑制血小板的聚集和凝血因子Ⅷ和Ⅸ的活化,可能有助于抑制动脉血栓的形成和防治心血管疾病。此外,我们课题组研究表明,DHC可通过PPARy/LXRa途径抑制高脂饮食的apoE-/-小鼠主动脉粥样斑块的形成,这些结果提示DHC与心血管疾病,特别是动脉粥样硬化的防治密切相关。载脂蛋白M(apoliprotein M, apoM)属于Lipocalin蛋白超家族成员,主要由肝脏及肾脏组织产生。肝脏中的apoM主要存在于肝细胞,绝大部分肝脏中的apoM分泌入血浆并整合到脂蛋白中,对apoM在血浆脂蛋白中分布的研究发现,绝大部分apoM分布在高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HDL)中(96%apoM存在于HDL),极少数的apoM也存在于低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein, LDL)、极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein, VLDL)和甘油三酯(Triglyceride, TG)等脂蛋白中。研究表明,apoM在Prep-HDL的形成和细胞内胆固醇流出至HDL中起着重要作用,采用RNA干扰技术将小鼠apoM基因沉默后,小鼠肝脏和血浆中apoM的表达减少,apoM表达减少后可以导致血浆中Prep-HDL缺失,使得血浆中HDL的浓度降低。Lee等研究发现,糖尿病兔动物模型中血浆apoM的浓度和肝脏apoM mRNA的表达水平显著下降,提示糖尿病动物模型中apoM的低表达可能由于高血糖导致的。这些研究结果提示apoM在动脉粥样硬化和糖尿病的发生发展中起着重要的作用。转录因子叉头框蛋白A2(forkhead box A2, Foxa2),基因定位于染色体20p11.21,是参与肝脏葡萄糖稳态和脂质代谢的转录因子。Foxa2在低胰岛素水平时定位于细胞核并可转录激活诱导脂肪酸氧化和酮体生成相关基因的转录和促进VLDL的分泌以及胆汁酸的代谢。当血浆胰岛素水平升高时,激活胰岛素受体,Foxa2发生磷酸化反应且从细胞核中排出,其转录活性受到抑制。已有研究表明,转录因子Foxa2与apoM启动子的结合位点在-474。高胰岛素小鼠肝脏组织apoM的表达和血浆Prep-HDL的减少是由于Foxa2的失活所致。对野生型小鼠和糖尿病模型ob/ob小鼠尾静脉注射突变型不能被磷酸化的Foxa2后,不仅能促进小鼠肝脏葡萄糖和脂质的代谢,还能上调apoM的表达。反之,Foxa2单倍剂量不足的Foxa2+/-小鼠肝脏的apoM表达水平与血浆Preβ-HDL、HDL的浓度显著下调,提示Foxa2可以调控apoM的转录表达。肝X受体(Liver X Receptor, LXR)是胆固醇代谢的主要转录因子,LXRa主要在脂质代谢活跃的组织如白脂肪组织、肝脏、小肠、脾、脑垂体和巨噬细胞中表达,可参与调节脂质的代谢平衡。Zhang等研究发现apoM基因是受LXRa调控的靶基因之一,LXR激动剂T0901317在体内外均能显著降低apoM的表达,进一步研究发现,用T0901317处理小鼠后,小鼠血浆中apoM表达水平明显降低。相同的是,在HepG2细胞培养过程中加入T0901317也会下调apoM的表达。这些研究结果提示,apoM是LXR调控的靶基因之一,且T0901317联合9-顺式视黄酸能显著下调apoM的表达,表明LXR/RXR(视黄醛受体)途径与LXR调控apoM表达相关。但是,DHC是否可影响apoM的表达及其相关作用机制尚未见相关文献报道,Foxa2和LXRa是否参与DHC调控apoM的表达尚不清楚。本研究发现。DHC可通过抑制Foxa2和增强LXRa下调HepG2细胞中apoM的表达。研究方法1、DHC的配制DHC为脂溶性物质,溶于无水乙醇溶液中,配置成初浓度为1mol/L的储存液,接着用无菌生理盐水按不同浓度要求0、25、50、100uM进一步溶解稀释,最终DHC的工作液中乙醇浓度为0.1%,同时以等体积的含有0.1%乙醇的生理盐水作为空白对照处理细胞,工作液都是在处理细胞前现配现用。2、细胞培养HepG2细胞生长于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中,37℃、5%C02恒温细胞培养箱中静置培养。培养过程中加入1% 100 U/ml的青霉素和100pg/mL的链霉素,每隔2-3天传代一次,取对数生长期细胞进行实验。细胞接种在6孔板或12孔板中,待其生长到汇合度达60-80%进行处理。3、实验动物8周龄的雌性C57BL/6小鼠10只,均重20g,随机分为2组,每组5只：(1)对照组,用不含胆固醇的植物油灌胃处理(0.2ml/只),1次/天；(2)DHC处理组,用溶解有DHC的无胆固醇的植物油灌胃处理(0.2 ml/只,按DHC3.0mg/kg的剂量),1次/天。饲养条件为每笼5只,室温25℃,正常饲料饲喂并给予每12小时光照/黑暗循环。1周后,对动物进行麻醉,颈椎脱臼法处死小鼠后分离肝脏组织进行后续实验。4、RNA提取和实时荧光定量PCRTRIzol试剂盒提取培养细胞和小鼠肝脏组织的总RNA,将1μg总RNA用逆转录试剂盒反转录成20μl cDNA。实时定量PCR在ABI 7500FAST上进行,溶解曲线分析表明PCR反应是否特异,以GAPDH表达量为内参并以△△Ct方法定量mRNA的相对表达量。5、免疫印迹(Western blot analyses)蛋白提取试剂盒提取细胞及小鼠肝脏组织的蛋白,对蛋白提取物定量后向蛋白提取物中加入5X的SDS,混匀并煮沸10分钟,冷却后置冰箱待用。10%琼脂糖凝胶电泳分离目的蛋白,按说明书要求依次电泳、转膜、封闭后以兔多克隆抗APOM、Foxa2、LXRa和β-actin一抗孵育过夜,洗涤孵育二抗再洗涤后,以化学发光法显示条带,检测目的蛋白的相对表达量。6、转染小分子RNAHepG2细胞接种在6孔板(2×106/孔),待细胞贴壁后用Lipo2000转染Foxa2、LXRa和空载siRNA,Trizol收集并裂解细胞,提取总RNA用于mRNA检测,收集总蛋白用于免疫印迹的检测。7、构建重组质粒通过PCR将PCR-XL-TOPO和PIRES2-EGFP2个片段拼接为EcoRI-Foxa2-IRES-EGFP-XhoI或EcoRI-LXRa-IRES-EGFP-XhoI的全长目的片段,并将其连接到pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-Foxa2或pcDNA3.1-LXRα。通过Lipo2000将重组质粒转染到培养的细胞中,Trizol收集并裂解细胞,提取总RNA用于mRNA检测,收集总蛋白用于免疫印迹的检测。8、统计分析计量数据以x±s表示,各基因mRNA相对表达量、各蛋白免疫印迹条带相对灰度值的比较采用单因素方差分析。每组实验重复3次,采用SPSS 13.0软件进行数据分析,P0.05认为差异有统计学意义。结果1、DHC可浓度和时间依赖性减少HepG2细胞中apoM基因和蛋白的表达水平。ApoM主要在肝细胞及肾小管上皮细胞中表达,肝细胞合成的apoM可分泌入血,与血浆中的脂蛋白结合,血浆中96%的apoM存在于HDL。我们首先检测DHC对HepG2细胞中的apoM表达的影响,用0、25、50、100uM DHC分别处理HepG2细胞24小时,荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可浓度依赖性减少HepG2细胞中的apoM mRNA和蛋白的表达水平；用100uM DHC处理HepG2细胞后0、6、12、24h检测apoM基因和蛋白的表达水平,荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可时间依赖性减少HepG2细胞中的apoM mRNA和蛋白的表达。2、Foxa2参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调。以往研究表明,Foxa2是一种参与肝脏葡萄糖代谢的转录因子,apoM受Foxa2的直接调控,因此我们检测Foxa2是否参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调。荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可浓度依赖性减少HepG2细胞中的Foxa2 mRNA和蛋白的表达。接着我们采用小分子RNA干扰技术敲减HepG2细胞的Foxa2,Foxa2表达量减少了87%。Foxa2 siRNA处理HepG2细胞后,DHC抑制apoM表达的效应更加显著；相反,用重组的Foxa2质粒过表达HepG2细胞后,Foxa2表达量增加了565%。Foxa2重组质粒处理HepG2细胞的Foxa2后,DHC抑制apoM表达的效应被部分抵消。3、DHC通过增加LXRa来下调HepG2细胞中apoM的表达。已有研究表明,用LXR激动剂T0901317处理HepG2细胞后,apoM mRNA表达水平显著下调,且T0901317处理小鼠后,小鼠血浆中apoM表达水平也出现明显降低。因此我们检测LXRa是否参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调。荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可浓度依赖性增加HepG2细胞中的LXRa mRNA和蛋白的表达。采用小分子RNA干扰技术敲减HepG2细胞的LXRa后,LXRa表达量减少了91%,免疫印迹的结果显示LXRa siRNA处理后DHC抑制apoM的表达被部分逆转；相反,用重组的LXRa质粒处理HepG2细胞后,LXRa表达量增加了617%,过表达LXRa后DHC抑制apoM表达的效应更加明显。4、DHC可下调小鼠肝脏组织apoM的表达。肝脏是主要产生和降解血液循环中含apoM脂蛋白的组织器官,我们在体外实验已证实,DHC可以通过抑制Foxa2和增强LXRa来减少HepG2细胞中的apoM基因和蛋白的表达,因此我们下一步检测DHC对C57BL/6小鼠肝组织apoM、Foxa2和LXRa的影响。10只雌性的C57BL/6小鼠随机分成两组,(1)对照组,用无胆固醇的植物油灌胃处理(0.2ml/只),1次/天；(2)DHC组,用溶含有DHC的无胆固醇的植物油灌胃处理(0.2 ml/只,DHC 3.0mg/kg),1次/天。一周后麻醉,颈椎脱臼法处死小鼠,取小鼠肝脏组织进行免疫印迹的测定,结果显示,与对照组相比,DHC灌胃处理C57BL/6小鼠后,肝脏apoM的表达减少、LXRa表达增加并且Foxa2表达减少。结论1、DHC可浓度和时间依赖性减少HepG2细胞中apoM基因和蛋白的表达水平。2、DHC可浓度依赖性减少HepG2细胞中的Foxa2 mRNA和蛋白的表达,采用RNA干扰技术敲减Foxa2后,DHC抑制apoM表达的效应更加显著；过表达Foxa2后,DHC抑制apoM表达的效应被部分抵消。3、DHC可浓度依赖性增加HepG2细胞中的LXRa mRNA和蛋白的表达,采用RNA干扰技术敲减LXRa后,DHC抑制apoM的表达被部分逆转；过表达LXRa后,DHC抑制apoM表达的效应更加明显。4、DHC灌胃处理C57BL/6小鼠后,肝脏apoM的表达减少、LXRa表达增加并且Foxa2表达减少。
【关键词】：二氢辣椒碱 载脂蛋白M Foxa2 肝X受体α
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-22
• 材料和方法22-41
• 1. 实验材料22-26
• 2. 主要溶液的配制方法26-27
• 3. 实验方法27-41
• 实验结果41-53
• 1. DHC可减少HepG2细胞中的apoM mRNA和蛋白的表达水平41-43
• 2. Foxa2参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调43-47
• 3. DHC通过增加LXRa来下调HepG2细胞中apoM的表达47-51
• 4. DHC对小鼠肝脏组织apoM表达的影响51-53
• 讨论53-59
• 参考文献59-65
• 全文小结65-66
• 英文缩写词一览表66-67
• 综述67-76
• 参考文献72-76
• 攻读学位期间成果76-78
• 致谢78-79

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 黄健;黄海;黄楙祝;张姝;王锦支;;载脂蛋白M启动子基因多态性及其表达与冠心病的关系[J];临床心血管病杂志;2013年09期

2 张效林;张保海;梁振洋;孙莹;冯雪瑶;韩雅玲;;中国汉族人群载脂蛋白M基因-778T/C多态与2型糖尿病合并冠心病的关联研究[J];岭南心血管病杂志;2013年06期

3 姚霜;郑璐;;载脂蛋白M启动子区基因多态性的临床研究进展[J];临床检验杂志;2014年11期

4 杜文涵;王玲;李慧;刘茵茵;申婷;胡敏;;系统性红斑狼疮患者血清apo M的表达及其与疾病活动度的相关性[J];中南大学学报(医学版);2015年04期

5 段宙位;窦志浩;张容鹄;谢辉;何艾;;黄灯笼椒中高纯度辣椒碱类化合物的制备研究[J];食品工业科技;2014年12期

6 白露露;胡文忠;姜爱丽;刘程惠;刘易伟;;辣椒加工工艺及其设备的应用现状[J];食品工业科技;2014年15期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 谭胜玉;慢性间歇性低氧对HDL代谢的影响及相关机制的研究[D];中南大学;2014年

2 马欣;异丙酚通过HNF-1α/apoM途径抑制炎症反应的机制研究[D];南方医科大学;2013年

3 郑璐;载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性[D];苏州大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 刘燕;ApoM启动子-855位点突变对基因转录调控作用的影响[D];蚌埠医学院;2013年

2 刘小花;核受体FXR下调载脂蛋白M表达的分子机制[D];重庆医科大学;2013年

3 潘艺;APOM在胆汁酸代谢LRH-1通路中作用的初步研究[D];中南大学;2013年

4 常乐;载脂蛋白M基因单核苷酸多态位点rs805297与中国汉族人群冠心病的相关性研究[D];华中科技大学;2013年

5 秦莉;应用碱基淬灭探针法检测α-1抗胰蛋白酶基因342Glu→Lys突变[D];苏州大学;2014年

6 郭伶霞;载脂蛋白M与细菌感染程度及其调节机制的研究[D];中南大学;2014年

  本文关键词：二氢辣椒碱通过抑制Foxa2和增强LXRα下调HepG2中apoM的表达，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：346435