内毒素在高糖高脂诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用
本文关键词：内毒素在高糖高脂诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:采用高糖高脂饮食诱导建立非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠模型,通过检测血浆内毒素(lipopolysaccharide,LPS)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和CD68(巨噬细胞标记物)以及内质网应激(endoplasmic reticulum,ERS)重要相关因子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)的表达,观察大鼠肝细胞凋亡水平变化特点,探讨LPS在大鼠NASH发生发展中的作用机制。方法:1.建立NASH大鼠模型及分组:30只雄性SD大鼠均给予标准基础饲料,自由进食饮水三天后,随机分为9周组:Synthetic diet+saline组(n=5)、Synthetic diet+LPS组(n=5)、Regular diet+LPS组(n=5)和Regular diet+saline组(n=5),另外设立5周组:Synthetic diet组(n=5)和Regular diet组(n=5),并在第5周末将大鼠进行麻醉后处死以观察Synthetic diet对大鼠肝脏影响。Synthetic diet配方为68.75%普通饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇+0.25%胆酸。自第6周开始,9周组动物在相同条件下隔日皮下注射LPS 0.5mg/Kg或相同剂量的生理盐水,所有大鼠自由进食与饮水。在实验第9周末,1%戊巴比妥钠3ml/Kg腹腔注射麻醉动物,无菌无热原条件下取腹主动脉血,3500rpm离心后取血浆置于 70℃冰箱冻存备用。取部分肝左叶10%福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,余肝组织置于㧟70℃冰箱备用。2.5周组肝组织切片HE染色,在光镜下观察肝脏病理学变化。采用放免法测定9周组血浆TNF-α水平;赖氏2、4-二硝基苯肼比色法测定9周组血浆ALT活性;鲎试剂法测定9周组血浆LPS水平。采用免疫组织化学方法测定9周组肝脏CD68(巨噬细胞标记物)的表达。采用TUNEL法测定9周组肝细胞凋亡水平。采用Western blot法测定9周组肝组织GRP78蛋白表达量。结果:1.HE染色在光镜下可见5周正常对照组肝组织肝小叶结构完整,肝细胞核圆位于中央,呈条索状排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞内未见脂滴,而5周高糖高脂饮食组肝细胞体积增大,可见小泡脂滴,细胞轮廓模糊,肝细胞呈轻度脂肪变性。2.9周组中Synthetic diet+saline组血浆LPS、ALT、TNF-α水平显著高于Regular diet+saline组,具有统计学差异(p0.05);Synthetic diet组经LPS处理后,血浆LPS、ALT、TNF-α水平显著高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组(p0.05);而在Regular diet组经LPS处理后,与Regular diet+saline组相比血浆LPS、ALT与TNF-α水平无明显变化(p0.05)。3.9周组中Regular diet+saline组肝脏较少见CD68阳性单核巨噬细胞浸润,当其经LPS处理后CD68阳性细胞无明显增多(p0.05);Synthetic diet+LPS组(0.140±0.018)可见大量巨噬细胞浸润,CD68阳性表达量与Regular diet+LPS组(0.053±0.018)、Synthetic diet+saline(0.100±0.017)组相比均有显著差异(p0.05)。4.9周组中Synthetic diet组经LPS处理后GRP78蛋白表达水平明显上调,要显著高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组(p0.05);Synthetic diet+saline组高于Regular diet+saline组(p0.05);Regular diet组经LPS处理后与Regular diet+saline组相比无显著差异(p0.05)。5.在9周正常对照组偶见少量的肝细胞凋亡,经LPS处理后,与正常对照组相比可以看到肝细胞凋亡数量无明显变化,凋亡率无显著差异(p0.05);Synthetic diet+saline组肝细胞凋亡增多,凋亡率升高,经LPS处理后肝细胞凋亡率达到最高值(57.08±6.21),与Synthetic diet+saline组(32.10±3.64)、Regular diet+LPS组(7.08±2.64)相比均差异显著,有统计学意义(p0.05)。6.经Pearson’s相关性分析,LPS与ALT表达明显正相关,r=0.78,p0.05;CD68与TNF-α表达明显相关,r=0.64,p0.05,GRP78表达量与肝细胞凋亡数呈明显正相关,r=0.77,p0.05。结论:1.高脂高糖饮食可以诱导建立NASH大鼠模型;2.LPS可对肝脏造成“二次打击”,促进了NASH的发生发展;3.LPS可激活大鼠肝脏巨噬细胞释放大量促炎因子TNF-α;4.在NASH大鼠肝组织中存在内质网应激反应,促炎因子TNF-α可能是引起内质网应激的重要因子,而且内质网应激参与了肝细胞凋亡这一病理过程。
【关键词】：非酒精性脂肪性肝炎 LPS TNF-α 内质网应激 肝细胞凋亡
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.1
【目录】：
- 摘要6-9
- abstract9-12
- 前言12-14
- 1 材料与方法14-20
- 1.1 材料14-15
- 1.2 主要试剂的配制15-16
- 1.3 分组与样本采集方法16
- 1.4 指标检测16-19
- 1.5 图像采集分析及统计学处理19-20
- 2 结果20-26
- 2.1 肝脏组织学观察20
- 2.2 生化指标检测20-21
- 2.3 免疫组化检测21-22
- 2.4 GRP78蛋白表达结果22-23
- 2.5 肝细胞凋亡变化23-25
- 2.6 相关性分析25-26
- 3 讨论26-32
- 3.1 本实验大鼠模型的建立与评价26
- 3.2 NASH的发病机制26-27
- 3.3 LPS引起炎症反应27-28
- 3.4 炎症与内质网应激28-30
- 3.5 内质网应激与肝细胞凋亡30-32
- 4 结论32-33
- 参考文献33-38
- 综述38-50
- 参考文献44-50
- 致谢50-51
- 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果51-52
- 个人简历52
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本文编号：382654
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