五子衍宗丸对幼年雄性大鼠睾丸Ki67、AR表达以及性激素的影响

发布时间：2017-08-21 20:29

  本文关键词：五子衍宗丸对幼年雄性大鼠睾丸Ki67、AR表达以及性激素的影响

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【摘要】：研究背景和目的：近年来,男性不育的比例逐年上升,全世界不育夫妇约占育龄夫妇的15%,其中男方因素约占50%。多种原因可以导致男性不育,其中无精,少精,弱精或者畸形精子均属精子发生障碍中最常见的原因。中医理论认为肾藏精,主生殖,肾精的充盛与否决定着生殖能力的强弱。历代医家都很重视补肾填精法在治疗男性生殖系统疾病中的重要作用,认为肾精亏虚是导致男性生殖能力减弱的主要原因。五子衍宗丸具有补肾填精、促进生殖的功能,由枸杞子、覆盆子、车前子、菟丝子、五味子组成,是中医治疗男性不育的经典方剂。目前临床和动物实验研究以不育患者或者各种造模后的实验动物作为研究对象,探讨病理状态下五子衍宗丸对生殖功能异常的改善或治疗作用,而生理状态下,五子衍宗丸能否促进幼年大鼠生殖功能发育成熟还不清楚。此外,前期的研究多局限于精子功能的概述,比如精子的数量和活动度,而尚未发现从曲细精管中支持细胞与生精细胞功能的变化来探讨幼年大鼠睾丸生殖功能的研究。本研究的目的是以幼年雄性大鼠为研究对象,从FSH、LH、T的变化,Ki67、AR和CK-18的变化以及睾丸间质细胞、精子细胞变化来探讨五子衍宗丸是否能促进幼年大鼠的生殖功能,为肾主生殖的中医理论提供现代科学依据。研究方法：实验一：(1)20d龄Wistar雄性大鼠40只,随机分为5组：20d组、30d组、40d组、50d组、60d组,每组8只。给予正常的饮食和水,分别在第Od、10d、20d、30d、40d后腹主动脉取血、睾丸取材。(2)放射性免疫法测定大鼠血清激素水平：卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)。(3) RT-PCR:Ki67、AR、CK-18基因表达。实验二：(1)20d龄Wistar雄性大鼠16只,随机分为正常组和给药组2组,每组8只。给药组每天给予五子衍宗丸灌胃,正常组给予等体积生理盐水,连续灌胃10d,每天一次。10%水合氯醛麻醉后,腹主动脉取血,双侧睾丸取材。(2)放射性免疫法测定大鼠血清激素水平：FSH、LH、T。(3)HE染色：观察睾丸曲细精管内形态,并做形态计量。(4)免疫组织化学方法：Ki67蛋白的表达。(5) RT-PCR:CK-18、AR、Ki67基因表达。(6) Western-Blot:CK-18、AR蛋白的表达。研究结果：实验一：(1)血清激素检测结果：与20d组相比,30d组血清T水平显著降低(P0.05),40d组、50d组、60d组均没有明显变化(P0.05)；与20d组相比,30d组、40d组、50d组、60d组血清FSH水平和LH水平均没有明显变化(P0.05)。(2) RT-PCR检测结果：与20d组相比,30d组Ki67mRNA的表达没有明显变化(P0.05),40d组、50d组、60d组Ki67mRNA的表达明显降低,(P0.05)；与20d组相比,30d组、40d组、50d组、60d组ARmRNA和CK-18mRNA的表达均明显降低(P0.05)。实验二：(1)血清激素检测结果：与正常组相比,给药组血清T水平显著升高(P0.05)；给药组血清FSH水平和LH水平有升高的趋势(P0.05)。(2)HE染色结果：30d龄大鼠均没有变形的精子细胞和精子出现,其曲细精管出现两种明显不同的形态：Ⅰ型只包含有精原细胞和精母细胞；Ⅱ型还出现了圆形的精子细胞。与正常组相比,给药组Ⅰ型曲细精管占总曲细精管个数比明显降低(P0.05)；Ⅱ型曲细精管占总曲细精管个数比明显升高(P0.05)；Ⅰ型和Ⅱ型曲细精管平均细胞个数均明显升高(P0.05)；间质细胞平均个数明显升高(P0.05)。(3)免疫组化结果：Ⅰ型曲细精管中,Ki67主要在精原细胞和初级精母细胞表达；而在Ⅱ型曲细精管中,Ki67主要在精原细胞中表达。和正常组比较,给药组Ⅰ型和Ⅱ型曲细精管内的Ki67表达水平都明显升高(P0.05)。(4) RT-PCR检测结果：与正常组相比,给药组Ki67 mRNA和AR mRNA表达量明显增高(P0.05),CK-18的表达没有明显变化(P0.05)。(5) Western blot检测结果：与正常组比较,给药组AR蛋白水平明显升高(P0.05)；CK-18的蛋白水平没有明显变化(P0.05)。研究结论：(1)幼年雄性大鼠在发育过程中,可能通过T和AR的变化调控支持细胞的成熟和生精细胞的增殖,促进生殖功能的完善。其中雄性大鼠30d龄时可能是调控的关键时期。(2)五子衍宗丸的作用靶点之一在睾丸,可能通过促进未成熟睾丸间质细胞的增殖,进而使睾酮合成增多。(3)五子衍宗丸在生理状态下,可能通过上调T和AR水平,促进幼年雄性大鼠支持细胞发育,促进早期精原细胞和初级精母细胞增殖,从而促进雄性生殖功能。
【关键词】：五子衍宗丸 雄激素受体 雄性生殖 支持细胞
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文缩略词表9-10
• 第一部分 文献综述10-29
• 综述一 五子衍宗丸的药理作用及临床应用研究进展10-21
• 1 五子衍宗丸的药理作用10-13
• 2 五子衍宗丸的临床应用13-16
• 3 结语16-17
• 参考文献17-21
• 综述二 睾丸支持细胞的中西医研究进展21-29
• 1 支持细胞的作用21-22
• 2 环境以及理化因素对支持细胞的损害22-24
• 3 中药对支持细胞的作用24-25
• 4 结语25-26
• 参考文献26-29
• 第二部分 实验研究29-51
• 实验一 幼年雄性大鼠发育过程中睾丸Ki67、AR表达以及性激素的变化29-37
• 前言29
• 1 材料及方法29-32
• 2 结果32-34
• 3 讨论34-37
• 实验二 五子衍宗丸对幼年雄性大鼠睾丸Ki67、AR表达以及性激素的影响37-51
• 前言37
• 1 材料及方法37-44
• 2 结果44-48
• 3 讨论48-51
• 参考文献51-54
• 结语54-55
• 致谢55-56
• 个人简历56

【参考文献】

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本文编号：714953