JNK1与TIPE2在感染后膈肌无力发生中调控机制的研究

发布时间：2017-08-30 07:25

  本文关键词：JNK1与TIPE2在感染后膈肌无力发生中调控机制的研究

  更多相关文章： 膈肌无力 JNK1 TIPE2 SP600125

【摘要】：背景在人体与呼吸有关的呼吸肌中,膈肌(diaphragm)是最重要的,呼吸肌功能的60%~80%都是由膈肌完成的,所以膈肌对于维持生物体的呼吸功能具有不可替代的作用。研究发现,机体在受到病毒、细菌等引起的感染时会引起膈肌收缩功能障碍,出现无力现象,但是对于该现象的机制一直没有研究清楚。临床上造成感染的可能原因比较广泛复杂,比如胸腹部感染,败血症和感染性休克等,我们课题组一直从事于膈肌无力机制的研究,对于LPS诱导的内毒素血症型大鼠中膈肌功能障碍研究具有一定前期基础,对于其相关发生机制的研究是本实验的主要目的。根据本组之前研究的结果,发现JNK1通路在膈肌无力的发病过程中具有明显作用,据此本实验利用LPS(Lipopolysaccharide)作用于大鼠造成感染,构建大鼠膈肌肌无力模型,研究LPS诱导的内毒素血症大鼠中可能导致膈肌功能障碍的有关蛋白的表达及其变化情况,同时腹腔注射SP600125(JNK1抑制剂),观测JNK1通路被抑制之后,大鼠膈肌的有关功能是否得到保护,大鼠膈肌的收缩功能是否得到某种程度上的恢复。TIPE2作为免疫负调控因子在炎症的过程中起到非常重要的作用,本实验同时对TIPE2等基因做了检测,以期阐明JNK1通路中有关蛋白的表达情况以及TIPE2基因在膈肌无力中起到的作用。目的构建内毒素血症大鼠膈肌无力模型,研究JNK1通路有关蛋白以及TIPE2基因在膈肌无力中的作用,同时构建小鼠骨骼肌细胞C2C12细胞LPS感染模型,进一步研究JNK1通路的有关调控机制。方法雄性SD大鼠40只,精神状态良好,体重180~220g,用随机分组的方法分为对照组、LPS模型组以及LPS+SP600125(JNK1抑制剂)组。给药方法:对照组的10只大鼠给予腹腔注射生理盐水;LPS组15只,腹腔(i.p)注射LPS(12mg/kg);LPS+SP600125组15只,腹腔(i.p)注射LPS的同时给予腹腔注射SP600125(30μM/kg)所有分组处理24h后处死;另外,每组皮下注射30ml/kg的生理盐水。24h后将大鼠进行麻醉行气管插管,记录呼吸功能有关参数、对动脉血气进行分析并且将大鼠膈肌离体分离制备膈肌肌条分别测定单收缩张力(Pt)同时测定最大强直张力(Po)、进而用Med Lab信号采集系统收集峰值收缩时间(CT)、半舒张时间(1/2RT)、张力最大上升速率(+d T/dtmax)、张力最大下降速率(-d T/dtmax)、张力-频率曲线(Force-frequency curve)及疲劳指数(FI)的变化,同时收集膈肌标本用于Western Bolt、RT-PCR等实验测定有关基因及蛋白的表达情况,并用HE染色和免疫组化的方法观察膈肌组织的形态变化。构建JNK1、TIPE2过表达和沉默质粒,将质粒转染至小鼠骨骼肌细胞C2C12感染模型中利用Western Blot、RT-PCR以进一步探讨JNK1通路、TIPE2基因在膈肌无力中的作用机制。结果(1)与对照组相比,LPS组大鼠无论在潮气量还是肺通气量及最大肺通气量均明显降低(P0.01)。LPS+SP600125组与LPS组比较各值均明显提高(P0.01)。(2)与对照组相比,LPS组大鼠膈肌Pt、Po、+d T/dtmax、-d T/dtmax明显降低,CT、1/2RT明显增高(P0.01)。LPS+SP600125组与LPS组比较,大鼠膈肌的Pt、Po、+d T/dtmax、-d T/dtmax显著提高(P0.01),CT、1/2RT明显降低(P0.01);LPS+SP600125组与对照组比较,Pt、Po、CT、1/2RT、+d T/dtmax、-d T/dtmax差异无统计学意义(P0.05)。(3)Western Blot显示LPS组TIPE2、p-JNK的表达量明显升高,而JNK1无明显变化,LPS+SP600125组JNK1得到抑制之后,JNK1的激活体表达降低,TIPE2的表达表达亦呈现明显的下降趋势,RT-PCR得到一致结果。(4)利用HE染色方法显示,对照组大鼠的膈肌肌纤维形状较为规则,排列相对整齐,相比而言LPS组大鼠的膈肌肌纤维则呈现出走向紊乱状况,甚至断裂溶解,间质水肿。(5)免疫组化结果显示TIPE2在LPS组的表达明显高于Control组,颜色较深,差异具有统计学意义(P0.05),JNK1的检测结果显示无明显变化。(6)不同时间点的C2C12肌细胞感染模型显示,p-JNK、TIPE2随着LPS刺激时间的增加表达增多,24h之后表达会下降。之后又构建JNK1、TIPE2过表达载体转染至C2C12细胞,利用RT-PCR方法检测发现,两者的表达趋势呈正相关性,这与动物模型实验结果一致。结论1、内毒素血症大鼠出现膈肌无力表现,注射SP600125之后膈肌功能得到改善,SP60125可能对膈肌具有一定的保护作用。2、LPS刺激大鼠之后可以激活JNK1通路,p-JNK、TIPE2表达升高;JNK1被抑制之后,p-JNK、TIPE2表达下降,膈肌收缩能力恢复,提示大鼠膈肌收缩能力的变化可能与JNK1通路的调控有关。3、JNK1与TIPE2存在正向调控关系。
【关键词】：膈肌无力 JNK1 TIPE2 SP600125
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R565
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-14
• 引言14-16
• 1 前言16-18
• 2 材料、仪器与试剂18-26
• 2.1 材料与试剂18-20
• 2.2 仪器20-21
• 2.3 部分溶剂配制方法21-26
• 3 实验方法26-40
• 3.1 动物模型建立26
• 3.2 动物模型相关指标检测26-28
• 3.3 总RNA的提取28-29
• 3.4 引物设计29-30
• 3.5 CDNA第一链的合成30
• 3.6 REAL- TIME PCR扩增目的基因30-31
• 3.7 蛋白质的提取及BCA法测定蛋白浓度31-32
• 3.8 WESTERN BLOT蛋白凝胶电泳32-33
• 3.9 膈肌标本的免疫组化33-34
• 3.10 感受态的制备34
• 3.11 TIPE2过表达载体的构建34-37
• 3.12 JNK1慢病毒载体以及TIPE2慢病毒载体的构建37
• 3.13 细胞培养及质粒转染37-38
• 3.14 统计学分析38-40
• 4 实验结果40-50
• 4.1 动物模型的成功构建40-42
• 4.1.1 各组大鼠一般情况40
• 4.1.2 呼吸功能的测定40
• 4.1.3 动脉血气分析40-41
• 4.1.4 膈肌收缩特性41
• 4.1.5 膈肌耐力的变化41-42
• 4.1.6 膈肌肌张力-频率关系42
• 4.2 形态学观察以及部分基因检测42-45
• 4.2.1 大鼠膈肌HE染色42-43
• 4.2.2 膈肌免疫组化结果43
• 4.2.3 WESTERN BLOT检测部分蛋白质表达43-45
• 4.2.4 REAL-TIME PCR检测部分基因45
• 4.3 JNK1与TIPE2的相互调节关系45-50
• 4.3.1 LPS刺激之后不同时间点蛋白表达情况45-46
• 4.3.2 TIPE2过表达载体的构建46-48
• 4.3.3 JNK1与TIPE2的表达相互调节关系48-50
• 讨论50-54
• 结论54-56
• 参考文献56-58
• 综述58-70
• 参考文献65-70
• 致谢70-72
• 在读期间参加的学术会议及研究成果72-73

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘宝军，，王希庆，刘卫东，吕福祯;小细胞未分化肺癌伴发严重肌无力综合征1例[J];哈尔滨医科大学学报;1994年06期

2 郭正科,王训凡;以肌无力就诊的甲状腺机能亢进症15例临床分析[J];中国急救医学;1999年03期

3 范小琴,赵忠新;肌无力综合征(附6例报告)[J];宁波医学;2000年01期

4 王学民,王满,彭绍周;砍离砂治疗肌无力致前壁截肢1例[J];中国误诊学杂志;2001年09期

5 吴健乾,孙元昌;肺癌合并肌无力综合症6例临床分析[J];浙江预防医学;2001年08期

6 卢建东,王广宇;林可霉素致肌无力1例[J];海军医学杂志;2003年04期

7 廖勇 ,史艳 ,柯珍群;肌注链霉素致肌无力病例1例报告[J];中国社区医师;2004年06期

8 孙美侬;以类肌无力综合征为首发表现的肺癌18例报告[J];山东医药;2005年24期

9 蒋建军,李金祥,韩俗,郑志洁,Robert Twycross;晚癌患者的兰伯特-伊顿肌无力综合征[J];中国医刊;2005年04期

10 杨玉新;崔岩松;;肌无力综合征误诊1例[J];中国乡村医药;2006年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 于海娜;江新梅;;小鼠急性氧化乐果中毒后肌无力的肌肉病理实验研究[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

2 刘晶瑶;江新梅;;小鼠急性氧化乐果中毒致肌无力的生化指标变化[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

3 陈眉;王晓杭;王静;张伟骏;裘昌林;;肌无力胶囊治疗重症肌无力的实验研究[A];2007年浙江省神经病学学术年会论文汇编[C];2007年

4 高心晶;秦英智;;机械通气与重症患者获得性肌无力[A];重症医学——2011[C];2011年

5 刘芳;蒲传强;;单纯性多发性肌炎62例临床及病理分析[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

6 吴健乾;孙元昌;;肺癌合并肌无力综合症6例报道[A];2005年浙江省呼吸系病学术年会论文汇编[C];2005年

7 朱琼;;氯氮平致肌无力一例报告[A];中国民政精神医学第四届学术会议论文集[C];1996年

8 张明霞;王晓宇;莫英曼;李龙;;肌痛、肌无力、肌酶升高并急性肾衰竭2例并文献复习[A];贵州省医学会风湿病学分会第四届学术年会专题论文汇编[C];2010年

9 陈荃;林志淼;李名扬;张洁;汪慧君;王晓雯;杨勇;;国内首报单纯型大疱表皮松解症伴肌无力一例[A];中华医学会第十八次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2012年

10 梁柯;;地塞米松滴眼致急性肌无力12例报告[A];第五次全国中西医结合神经科学术会议论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 周继明;遗传性“锋线肌无力”[N];中国体育报;2007年

2 江苏省淮安市第一人民医院 王玉玲　梁丽琴;治疗肌无力可尝试免疫功能再造[N];健康报;2011年

3 通讯员　梁时荣;太和医院干细胞移植治疗肌无力获突破[N];湖北日报;2007年

4 河北以岭医院 苏卫东;“从脾论治肌无力”不可泛用[N];中国中医药报;2013年

5 勾藤;管理“肌无力” 反成“黔之驴”[N];中国医药报;2006年

6 ;我国治疗肌萎缩、肌无力获得新突破[N];中国高新技术产业导报;2006年

7 河北以岭医院肌萎缩科 苏卫东 胡军勇;治“肌无力”苍术要因病而用[N];中国中医药报;2013年

8 上海市中医医院名老中医 李庚和;复视可能是肌无力的征兆[N];上海中医药报;2003年

9 韩咏霞;辛伐他汀可致肌无力[N];大众卫生报;2004年

10 尤 生;服减肥药可能导致肌无力[N];中国中医药报;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 曹承华;JNK1与TIPE2在感染后膈肌无力发生中调控机制的研究[D];河南大学;2015年

2 于海娜;小鼠急性氧化乐果中毒后肌无力的肌肉病理实验研究[D];吉林大学;2006年

3 林仕芳;单纯性多发性肌炎活动期的临床及实验室指标的探讨[D];福建医科大学;2004年

4 刘晶瑶;小鼠急性氧化乐果中毒致肌无力的生化指标变化[D];吉林大学;2006年

本文编号：757987