肾小管上皮细胞缺氧状况下细胞外基质代谢特点初步解析

发布时间：2018-01-28 08:11

  本文关键词： 缺氧 肾小管上皮细胞 转录组 基质金属蛋白酶-2　出处：《东南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景细胞外基质过度产生和降解减少是肾小管基底膜增厚的根本原因,但内在机制尚未完全研究清楚,如果能掌握细胞外基质代谢相关基因活动全貌将有助于阐明内在规律。基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase 2, MMP-2)是降解基底膜胶原的关键酶。体外研究发现,缺氧抑制肾小管上皮细胞MMP-2活性。然而,缺氧为什么引起MMP-2活性下降?调控机制至今仍未研究清楚。方法1.缺氧肾小管上皮细胞转录组分析用RNA测序方法,分别检测缺氧和常氧处理的肾小管上皮细胞整个转录组的变化。2.缺氧状况下,分别上调和下调自噬与内吞RAB7、自噬和内吞特异性抑制剂、自噬和内吞关键蛋白下调对MMP-2活性、表达和活性调节蛋白的影响。首先构建上调和下调RAB7基因载体；再用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和菲律平(filipin)分别处理细胞；接着下调自噬(Beclin-1)和内吞(Caveolin-1)的关键分子。用Zymography法分别测上清MMP-2活性；qRT-PCR检测细胞内MMP-2表达；ELISA方法测培养上清MMP-2和Ⅳ型胶原蛋白含量；Western blotting检测酶活性调节蛋白MMP-1、RECK、 TIMP-2表达。结果1.缺氧肾小管上皮细胞转录组分析获得2倍上调、下调以及统计学检验水平P0.05的基因共279个。与肾脏病相关的上调基因主要为：细胞外基质与受体相互作用、肾细胞癌、血管内皮生长因子、转化生长因子等；与肾脏病相关的下调基因主要为：抗原处理和递呈、内质网蛋白处理、能量产生、谷胱甘肽生成等。此外,还检测到缺氧细胞有51387选择性剪接、常氧细胞有49144选择性剪接和新转录组9394个以及单核苷酸多态性(SNP)69706个。2.缺氧状况下,上调和下调自噬和内吞共享分子RAB7对MMP-2活性、表达和活性调节蛋白的影响缺氧肾小管上皮细胞在上调RAB7基因的表达后,培养上清中MMP-2活性下降(缺氧+RAB7组：0.10±0.06；缺氧组：0.48±0.07,p0.01)、MMP-2 mRNA表达水平下降(缺氧+RAB7组：0.81±0.08；缺氧组：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量减少(缺氧+RAB7组：2.52±0.26μg/L；缺氧组：3.81±0.13μg/L,P0.01)、Ⅳ型胶原蛋白含量升高(缺氧+RAB7组：5.65±0.20μg/L；缺氧组：5.43±0.17μg/L,P0.05)；下调RAB7基因的表达,MMP-2活性明显升高(缺氧+RAB7shRNA组：1.00±0.08；缺氧组：0.48±0.07,P0.01)、MMP-2 mRNA表达升高(缺氧+RAB7shRNA组：3.80±0.23；缺氧组：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量增加(缺氧-1-RAB7 shRNA组：4.31±0.30μg/L；缺氧组：3.81±0.13μg/L, P0.05)、Ⅳ型胶原蛋白含量减少(缺氧·+RAB7shRNA组：5.01±0.20μg/L；缺氧组：5.43±0.17μg/L,P0.01)。缺氧肾小管上皮细胞上调RAB7基因的表达,酶活性调节蛋白TIMP-2和MMP-14表达下降；下调RAB7基因的表达,TIMP-2和MMP-14蛋白表达升高。与缺氧组相比,无论上调还是下调RAB7基因表达,酶活性调节蛋白RECK表达均下降；下调RAB7表达之后,RECK表达下降尤其明显(P0.01)。3.缺氧状况下,自噬和内吞特异性抑制剂对MMP-2活性、表达和活性调节蛋白的影响在缺氧条件下抑制自噬,培养上清MMP-2活性有所降低(缺氧+3-MA组：0.25±0.04；缺氧组：0.36±0.07,P0.05)、MMP-2 mRNA表达水平大幅提升(缺氧+3-MA组：15.53±2.12；缺氧组:1.24±0.16,P0.01)、MMP-2蛋白含量无显著变化(缺氧+3-MA组：3.67±0.20μg/L；缺氧组：3.71±0.12μg/L, P0.05)、Ⅳ型胶原蛋白含量略增加(缺氧+3-MA组：5.46±0.06μg/L;缺氧组：5.33±0.14μg/L,P0.05);抑制内吞能显著恢复MMP-2活性(缺氧+filipin组：0.60±0.08；缺氧组：0.36±0.07, P0.01)、MMP-2 mRNA表达上调(缺氧+filipin组：6.40±2.22；缺氧组：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量显著增加(缺氧+filipin组：4.44±0.31μg/L；缺氧组：3.71±0.12μg/L, P0.05)、Ⅳ型胶原蛋白含量有所下降(缺氧+filipin组：5.18±0.02μg/L；缺氧组：5.33±0.14μg/L, P0.05)。在缺氧情况下3-MA、filipin均抑制TMP-2的表达,而3-MA抑制效果更明显。3-MA和filipin都抑制RECK的表达。filipin;对MMP-14的表达水平有明显上调作用。用免疫荧光实验验证调控分子的变化,所得结果一致。4.缺氧状况下,自噬和内吞关键蛋白下调对MMP-2活性、表达和活性调节蛋白的影响缺氧情况下干扰Bec-1基因表达,培养上清MMP-2活性有所降低(缺氧+Bec-1shRNA组：0.35±0.17；缺氧组：0.49±0.02,P0.05)、MMP-2 mRNA表达水平升高(缺氧+Bec-1shRNA组：2.0±0.03；缺氧组：1.24±0.16, P0.05)、MMP-2蛋白含量无显着变化(缺氧Bec-1shRNA组：3.30±0.18μg/L；缺氧组：3.54±0.20μg/L, P0.05)、Ⅳ型胶原蛋白含量亦无显着变化(缺氧+Bec-1shRNA组：5.45±0.28μg/L；缺氧组：5.30±0.20μg/L, P0.05);干扰Cav-1基因表达,培养上清MMP-2活性升高(缺氧+Cav-1shRNA组：0.66±0.05；缺氧组：0.49±0.02, P0.01)、MMP-2 mRNA表达水平显着升高(缺氧-+Cav-1shRNA组：15.80±3.11；缺氧组：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量显着增加(缺氧+Cav-1shRNA组：4.15±0.26μg/L;缺氧组：3.54±0.20μg/L,P0.01)、Ⅳ型胶原蛋白含量有所减少(缺氧-+Cav-1shRNA组：4.90±0.60μg/L；缺氧组：5.30±0.20μg/L,P0.05)。缺氧状况下下调Bec-1基因或Cav-1基因表达,均能抑制TIMP-2的表达,Bec-1shRNA的抑制效果比Cav-1shRNA抑制效果明显。MMP-14的表达和TMP-2的表达情况相似。下调Beclin-1基因或Cav-1基因表达,均能抑制RECK表达,Bec-1shRNA抑制效果逊于Cav-1shRNA。结论1.结果提示,缺氧状况下,损伤修复相关基因活动明显增强导致细胞外基质产生增加；抗原处理和递呈相关基因、内质网蛋白处理相关基因、能量产生相关基因、谷胱甘肽生成相关基因下调,提示缺氧使细胞抗损伤能力下降；肾细胞癌相关基因上调提示慢性肾脏病患者肾细胞癌发病率升高可能与肾组织缺氧有关。2.从多角度证明,缺氧肾小管上皮细胞自噬与内吞影响MMP-2的表达或活性。自噬主要抑制MMP-2mRNA表达；而内吞则主要抑制MMP-2活性。3.缺氧肾小管上皮细胞Cav-1介导的内吞、RECK表达增加、TIMP-2和MMP-14表达下降均影响MMP-2活性,其中Cav-1介导的内吞可能是MMP-2活性下降的主要原因。4. Cav-1、RAB7可能是干预慢性肾脏病发展的潜在靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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