骨髓间充质干细胞通过miR-29c抑制前列腺癌细胞的功能及机制研究

发布时间：2018-03-31 20:44

本文选题：前列腺癌　切入点：间充质干细胞　出处：《第二军医大学》2014年博士论文

【摘要】：一、研究背景前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤之一。美国2012年前列腺癌新发病例241740例，其发病率为男性癌症之首，死亡率为癌症疾病第二位。在我国，由于人口老龄化、饮食结构改变以及诊断技术的提高，前列腺癌的发病率及死亡率均呈逐渐升高的趋势。虽然前列腺癌在我国的发病率远远没有美国及欧洲国家高，但我国前列腺癌的发病率呈逐年增加的趋势，且大部分前列腺癌患者就诊时已失去手术时机，应引起高度重视。对于晚期前列腺癌而不能手术患者，目前一线的治疗方法是内分泌和/或者化疗，以达到人工去势目的，即去雄治疗。对于已经发生转移的前列腺癌患者，这种治疗早期效果是满意的，但多数这样的患者会在三年左右复发，目前缺乏对于晚期前列腺癌的有效治疗方法，最终导致患者死亡。 MSCs(mesenchymal stem cells,间充质干细胞)是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。作为一种新型治疗手段具有广阔前景。自体干细胞容易获得且副作用小，避免了组织相容性不符和伦理学障碍等难题。此外，人们发现MSCs与肿瘤细胞之间的关系非常密切。MSCs可以被募集到肿瘤组织参与肿瘤微环境的重塑，二者之间的交互对话(crosstalk)对肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移等力学生物学行为产生了重要影响，，但其具体机制尚不明确。 miRNA是近年来发现的一类内源性非编码小RNA分子。新近研究表明，miRNA通过负性调控肿瘤相关基因的表达，在肿瘤发生发展中发挥重要作用。由于单一miRNA能够同时对多个靶基因的表达进行负性调控，研究miRNA及其作用的靶基因能更加清晰的阐明miRNA在肿瘤的生物学行为中发挥的作用。到目前为止，仅有少数miRNA被证实参与了前列腺癌的进展。我们在既往的研究中，利用miRNA表达谱芯片技术，率先发现在雄激素非依赖前列腺癌与雄激素依赖性前列腺癌癌存在多个差异表达的miRNA分子，并初步证实miR-663可以作为晚期前列腺癌的独立预后分子。Alex Yuan等研究发现骨髓间充质干细胞可以携带并释放miRNA分子而发挥相应功能。结合MSCs对肿瘤的交互作用，我们有理由相信miRNA可以作为重要线索来揭示MSCs对前列腺癌生物学的影响。二、研究目的针对在骨髓间充质干细胞可以明显抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖和侵袭的基础上，利用miRNA芯片筛选，得到在骨髓间充质干细胞抑制后的前列腺癌细胞与亲本前列腺癌细胞中成差异表达的miRNA表达谱，明确表达差异最明显的miRNA并在细胞及细胞培养液水平上进行验证，用多个生物信息学软件预测miR-29c的潜在靶基因，随后对预测到的靶基因进行GO功能聚类和pathway分析，初步判定并验证miR-29c的潜在靶基因（C7ORF24、COL6A2、PIK4CA）。深入探讨miR-29c/C7ORF24、COL6A2、PIK4CA通路在骨髓间充质干细胞抑制前列腺癌中的作用和可能机制，为临床治疗前列腺癌提供新的策略和思路。三、主要研究内容 1、抽取健康成人骨髓组织，分离、纯化、培养骨髓间充质干细胞，并通过形态学及流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞，为后续工作打下基础。 2、通过Transwell技术将骨髓间充质干细胞与前列腺癌LNCaP细胞共培养，观察前列腺癌LNCaP细胞的增殖及侵袭，明确骨髓间充质干细胞对前列腺癌LNCaP细胞的生物学作用。 3、将与骨髓间充质干细胞共培养的前列腺癌LNCaP细胞与野生型LNCaP细胞进行miRNA筛选，选择差异明显的miRNA（miR-29c）在细胞及细胞培养液水平进行验证，明确miR-29c是由骨髓间充质干细胞分泌并传递到前列腺癌细胞，并检验miR-29c对前列腺癌LNCaP细胞的生物学作用。 4、利用生物信息学分析和miRNA数据库，寻找miR-29c作用的靶基因，确定靶基因确切结合位点或者区域，通过Real time PCR以及Western blot试验，进一步明确miR-29c对靶基因的负性调控作用。四、结果 1、成功从健康成人骨髓组织中，分离纯化骨髓间充质干细胞，形态稳定，折光性好，鱼群样生长，流式细胞试验显示MSCs表达间充质干细胞表面标志分子CD29、CD90、CD73及CD105，不表达CD14以及造血干细胞标志分子CD34和CD45。 2、利用Transwell共培养技术发现MSCs可以明显抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭，证实MSCs可以抑制前列腺癌细胞的生物学功能。 3、利用miRNA表达谱芯片技术，筛选出在骨髓间充质干细胞抑制后的前列腺癌细胞与亲本前列腺癌细胞中成差异表达miRNA，其中miR-29c表达差异最明显，利用real-time PCR,验证了miR-29c在骨髓间充质干细胞共培养的前列腺癌细胞系中的表达明显高于亲本细胞，并发现miR-29c在骨髓间充质干细胞共培养的前列腺癌细胞培养液（无血清培养）中的表达高于亲本细胞的培养液，进一步证明了miR-29c是由骨髓间充质干细胞分泌并传递到前列腺癌细胞。 4、CCK-8方法检测转染了miR-29c的LNCaP细胞增殖明显抑制，通过流式细胞学检测发现转染了miR-29c的LNCaP细胞的S期细胞明显下降，显示miR-29c可以抑制前列腺癌细胞的分裂生长。 5、Transwell侵袭实验发现转染了miR-29c的LNCaP细胞穿过基质胶的细胞数量较对照组明显下降，提示miR-29c抑制了LNCaP细胞的侵袭能力。 6、采用多个生物信息学软件预测miR-29c的潜在靶基因，随后对预测到的靶基因进行GO功能聚类和pathway分析，初步判断其可能的靶基因为C7orf24、COL6A2、PIK4CA。对细胞转染miR-29c后，经过real time-PCR和Western blot试验证实C7orf24、COL6A2、PIK4CA三个基因在mRNA和蛋白水平明显下降，表明C7orf24、COL6A2、PIK4CA可能是miR-29c的靶基因。五、结论 1、本研究通过骨髓间充质干细胞对前列腺癌LNCaP细胞的体外功能试验表明，骨髓间充质干细胞可以通过增加LNCaP细胞S期细胞的数量，从而促进LNCaP细胞的增殖。同时也证实骨髓间充质干细胞通过增加前列腺癌LNCaP细胞穿过Transwell基质胶的细胞数量而增加LNCaP细胞的侵袭能力。因此骨髓间充质干细胞会在前列腺癌的生长及进展期发挥重要作用。 2、通过miRNA表达谱芯片技术，筛选出在骨髓间充质干细胞抑制后的前列腺癌细胞与亲本前列腺癌细胞中成差异表达最明显的miR-29c,并在细胞及细胞培养液水平验证了miR-29c的差异表达，表明是miR-29c由骨髓间充质干细胞分泌并传递到前列腺癌细胞，miR-29c可能是骨髓间充质干细胞抑制前列腺癌细胞的关键分子。 3、通过对LNCaP细胞转染miR-29c模拟物进行检测，发现miR-29c可以明显抑制LNCaP细胞的增殖和侵袭能力。这也在一定程度上证明miR-29c可以抑制前列腺癌的生物学行为。 4、通过对其靶基因的寻找发现C7orf24、COL6A2、PIK4CA可能是改变LNCaP细胞增殖侵袭能力的重要靶蛋白。然而miR-29c往往作用于多个通路及蛋白，miR-29c与蛋白的结合仍需报告基因实验予以完善。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【参考文献】