霉酚酸酯对糖尿病大鼠足细胞肥大及凋亡的影响及机制研究

发布时间：2018-05-12 02:43

  本文选题：霉酚酸酯 + 糖尿病肾病　； 参考：《山东大学》2014年博士论文

【摘要】：研究目的 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)以早期肾脏体积增大、晚期肾小球硬化为主要特征,肾脏细胞的增殖、肥大与凋亡参与了DN的发生、发展。本研究采用体内动物实验和体外细胞培养相结合的方法,通过观察糖尿病大鼠及高糖刺激下的肾小球足细胞肥大、凋亡状态,测定细胞周期蛋白激酶抑制剂(cyclin-kinase inhibitors, CKIs)p27kip1、p21cipt及凋亡相关基因bcl-2、bax、cleaved caspase-3的表达,观察霉酚酸酯(mycophenolate mofetil, MMF)对足细胞肥大、凋亡的影响,为治疗DN提供科学的理论依据。 研究方法 体内动物实验：32只雄性健康Wistar大鼠,腹腔内注射链脲佐菌素(STZ),另外8只作为对照组(NC)。注射STZ72小时后剪尾采血,测血糖16.7mmol/L,尿糖阳性,表明糖尿病模型成功建立。将糖尿病造模成功的32只大鼠,随机分为糖尿病组(DM)、霉酚酸酯组(DM+M)、缬沙坦组(DM+V)及霉酚酸酯+缬沙坦联合治疗组(DM+M.V),每组8只。成模2天后,治疗组分别给予MMF15mg.kg-1.d-1,缬沙坦40mg.kg-1.-1,联合治疗给予MMF15mg.kg-1.d-1+缬沙坦40mg.kg-1.d-1,1mg/d灌胃；而NC组和DM组每日予等量溶媒灌胃,共16周(w)。分别检测五组大鼠4w、8w及16w的左肾重/体重、血糖、血压、内生肌酐清除率及24小时尿蛋白排泄量；光学显微镜和电子显微镜观察糖尿病大鼠肾组织形态学的变化；免疫组织化学法检测肾皮质nephrin.WT1蛋白的表达；TUNEL法检测足细胞的凋亡率；Western-blot半定量及荧光实时定量PCR的分析方法,检测肾组织中p27kip1、p21cipt及bcl-2.bax.cleaved caspase-3的表达。 体外细胞实验：订购的小鼠肾足细胞,按培养液中葡萄糖、霉酚酸(mycophenolic acid,MPA).缬沙坦的含量不同分为：①正常对照组NG(葡萄糖浓度5.6mmol/L+2.5%FBS的DMEM);②高糖组HG(葡萄糖浓度25mmol/L);③HG+M组：HG(葡萄糖浓度25mmol/L)+MPA2.5×10-7mol/L;④HG+V组:HG(葡萄糖浓度25mmol/L)+缬沙坦10-7mol/L;作用72小时(h)。采用流式细胞仪测定12h、24h、48h、72h各时间点足细胞的肥大指数及凋亡率,运用Western-blot半定量及荧光实时定量PCR的分析方法,检测肾小球足细胞中p27kip1、p21cip1及bcl-2、bax、cleaved caspase-3的表达。 结果 1.临床参数 与NC组比较,DM大鼠血糖明显升高、体重减轻、肥大指数增加,24小时尿蛋白排泄量及肌酐清除率均明显增高(P0.01)。16周末,DM大鼠肾重/体重指数较NC组明显升高(8.49±1.21vs4.57±0.82,P0.01)；而霉酚酸酯和/或缬沙坦治疗16w后,肾重/体重指数明显降低,差异有显著性(PO.01)；但各药物治疗组间无统计学意义(P0.05)。16w末,DM大鼠尿蛋白量较NC组明显升高(55.37±2.33vs10.52±0.66,P0.05);同样药物治疗16w后,24小时尿蛋白排泄量明显降低,差异有显著性(P0.01)；各给药组间无统计学差异(P0.05)。 2.肾脏组织形态学观察 光镜：4周前糖尿病大鼠无明显变化。此后,随着实验周期的延长,糖尿病大鼠肾小球的体积逐渐增大、系膜区逐渐增宽,且基底膜增厚、毛细血管腔受压、变窄；与NC组比较,16周末DM组肾小球的硬化指数(1.15±0.12vs0.15±0.05,P0.01)及间质纤维化积分(0.58±0.08vs0.12±0.04,P0.01)明显增加,其差异有显著性；各药物治疗组较DM组均有不同程度的改善。 电镜：糖尿病大鼠肾小球毛细血管基底膜均质性增厚和系膜基质增多,伴足细胞足突的广泛融合,并可见裸露的基底膜及脱落的足细胞。MMF和/或缬沙坦治疗后,足突的融合减轻,系膜基质及足细胞的脱落均明显减少。 3.肾组织中nephrin、WT-1蛋白及mRNA的表达 免疫组织化学染色显示：正常大鼠nephrin、WT1沿肾小球基底膜呈棕黑色线形分布,而糖尿病大鼠的线样沉积变淡、变细、甚至消失,经MMF和/或缬沙坦治疗后,其线样沉积又恢复至粗线状。 从第4周开始糖尿病组大鼠肾组织中nephrin蛋白(2.08±0.42vs2.63±0.51,P0.05)及WT1蛋白(1.26±0.2vs1.59±0.26,P0.05)的表达减少,且随着时间的推移nephrin、WT1蛋白的表达进一步降低。各治疗组与DM组比较,nephrin、WT1的表达均有不同程度的升高(P0.05)；且16w末nephrin蛋白的表达DM+M组(1.83±0.43)及DM+M. V组(1.75±0.31)疗效优于DM+V组(1.39±0.28),有显著性差异(P0.05)；而各药物治疗组间WT1蛋白的表达无明显差异(P0.05)。 从第4周开始DM组大鼠肾组织中nephrin mRNA (0.87±0.13vs0.95±0.091, P0.05)、WT1mRNA (0.92±0.095vs1.04±0.079, P0.05)的表达下降,且随着时间的推移其mRNA的表达进一步降低。而经霉酚酸酯和/或缬沙坦治疗后,nephrin、WT1mRNA的表达均有不同程度的上调(P0.05),16周末WT1mRNA的表达霉酚酸酯联合治疗组(1.30±0.25)优于缬沙坦组(1.04±0.23),(P0.05),而nephrin mRNA的表达三治疗组间比较无明显差异(P0.05)。 4.足细胞肥大指数 高糖组足细胞肥大从24小时开始(0.828±0.23vs0.678±0.16,P0.05),且随着时间的推移足细胞进一步肥大。各治疗组与高糖组比较,霉酚酸治疗组足细胞肥大从24小时开始减轻,而缬沙坦治疗组从48小时开始明显减轻,且随着时间推移,疗效逐渐增强(P0.05)。 5. p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表达 体内动物实验：从第4周开始DM组大鼠肾组织中p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表达增强,与正常对照组相比有显著性差异(P0.05),16周末达高峰。各治疗组与DM组比较,p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表达从第8周开始降低(P0.05),且随着实验周期的延长,p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表达进一步降低；16w末p27kipl蛋白、mRNA及p21cip1mRNA的表达,霉酚酸酯+缬沙坦联合治疗组优于缬沙坦组(P0.05)。 体外足细胞培养：p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表达：从24小时开始,HG组小鼠足细胞p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA水平开始升高,与NG组相比差异有显著性(P0.05)。且随着时间的推移,p27kipl和p21cipl蛋白及mRNA的表达进一步升高。霉酚酸及缬沙坦可明显降低p27kip1和p21cip1蛋白的表达,且72小时末p27kip1蛋白的表达霉酚酸的疗效优于缬沙坦(P0.05)；霉酚酸和缬沙坦亦可明显降低p27kip1mRNA的表达,而p21cip1mRNA的表达仅霉酚酸起到明显的抑制作用。 6.足细胞凋亡率 体内动物实验：实验第8周糖尿病大鼠足细胞凋亡率开始增高(2.63±0.31vs0.84±0.26,P0.01),且随着实验的延长,足细胞凋亡率进一步增高。各治疗组与DM组相比,均有不同程度的下降；16周末霉酚酸酯单一治疗组(1.81±0.27)及联合治疗组(1.24±0.19)优于缬沙坦组(2.25±0.33),差异有显著性(P0.05)。 体外足细胞实验：高糖培养48小时后,足细胞凋亡率明显高于NG组(4.97±0.58vs2.77±0.31,P0.05)。两治疗组,仅霉酚酸治疗72小时后足细胞凋亡率降低(P0.05),而缬沙坦治疗组无变化(P0.05),且72小时末霉酚酸的疗效优于缬沙坦,差异有统计学意义(P0.05)。 7. bax、bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及mRNA的表达 体内动物实验：糖尿病大鼠的bax、cleaved caspase-3蛋白及mRNA的表达从实验第8周起明显升高,而bcl-2的表达下降,差异有显著性(P0.05)。各治疗组与DM组比较,其表达均有不同程度的改善；且16周末bax/bcl-2蛋白的表达,DM+M组(1.42±0.2)、DM+M. V组(1.57±0.26)与DM+V(1.95±0.24)比较差异有显著性,(P0.01)。 体外足细胞培养：高糖培养下,足细胞的bax、cleaved caspase-3蛋白及mRNA的表达从实验第48小时起升高,而bcl-2的表达下降,差异有显著性(P0.05),且随着时间的推移比值进一步升高。经霉酚酸或缬沙坦治疗后,其比值较HG组下降,差异有显著性(P0.01)；且72小时末bax/bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表达,HG+M组较HG+V组明显降低,差异有显著性(P0.05)。 结论： 1.足细胞的肥大与凋亡参与了糖尿病肾病的发生、发展。糖尿病早期,足细胞的肥大伴随着细胞周期蛋白激酶抑制剂p27kip1、p2cip1表达的增高。随着糖尿病病程的进展,足细胞的凋亡率增高,晚期的肾小球硬化与其过度凋亡有关,并伴随着凋亡相关基因bax、cleaved caspase-3表达的升高及bc1-2表达的降低。 2.霉酚酸酯和缬沙坦可有效的抑制肾小球足细胞的肥大与凋亡,调节细胞周期相关蛋白(p27kip1、p21cip1)和凋亡相关基因(bax、bcl-2、cleaved caspase-3)的表达,起到一定的保护作用。因此,推测霉酚酸酯可能通过调节细胞周期负性调控蛋白p27kip1、p21cip及凋亡相关基因bax、bcl-2及cleaved caspase-3的表达,抑制和阻断肾小球足细胞的肥大与凋亡,从而起到降低蛋白尿、延缓糖尿病肾病进展的作用。
[Abstract]:Purpose of study

Diabetic nephropathy ( DN ) was characterized by the increase of early renal volume , late glomerulosclerosis as the main characteristic , the proliferation , hypertrophy and apoptosis of kidney cells were involved in the development and development of DN .

Research Methods

In vivo animal experiment : Thirty - two male healthy Wistar rats were injected intraperitoneally with streptozocin and 8 as control group ( NC ) . Thirty - two rats were randomly divided into diabetic group ( DM ) , mycophenolate mofetil group ( DM + M ) , valsartan group ( DM + V ) and mycophenolate + valsartan combined therapy group ( DM + M.V ) .
The left kidney weight / body weight , blood glucose , blood pressure , endogenous creatinine clearance rate and 24 hour urinary protein excretion were measured in five groups of rats 4w , 8w and 16w .
Changes of renal tissue morphology in diabetic rats were observed by optical microscopy and electron microscopy ;
Expression of bax , bcl - 2 , caspase - 3 protein and mRNA
TUNEL method was used to detect the apoptosis rate of foot cells .
The expression of p27kip1 , p21 cipt and bcl - 2 . bax were detected by Western - blot semi - quantitative and real - time quantitative PCR .

In vitro cell experiment : The mouse kidney - foot cells were ordered , and glucose and mycophenolic acid ( MPA ) were added to the culture solution . The contents of valsartan were divided into two groups : 鈶，

本文编号：1876797