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转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

发布时间:2018-06-15 03:21

  本文选题:补体应答基因 + 髓锌指基因 ; 参考:《南京医科大学学报(自然科学版)》2015年02期


【摘要】:目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。
[Abstract]:Aim: to construct the luciferase reporter plasmid (full-length and truncated) of the rat complement response gene (32(response gene to complementation rGC32), and to observe the effect of overexpression of medullary zinc finger gene (1(myeloid zinc finger gene1mZF1) on the activity of rat RGC32 gene. At the same time, the possible MZF1 binding sites were screened. Methods: the full-length RGC32 promoter was inserted into the luciferase reporter gene vector pGL3-basic, and the full-length luciferase reporter plasmid pGL3-RGC32-FLR of RGC32 gene promoter was obtained. Then pGL3-RGC32-FL was co-transfected into HEK293 cells by pIRES2-EGFP-MZF1, which was constructed by our team. The luciferase activity was detected to determine the priming effect of MZF1 on RGC32 gene. In addition, bioinformatics software was used to predict the potential binding sites of transcription factor MZF1 on the promoter of RGC32 gene, and three luciferase reporter plasmids (pGL3-RGC32-1, pGL3-RGC32-2 and pGL3-RGC32-3pGL3-RGC32-3) were constructed. The full-length and truncated luciferase reporter plasmids of RGC32 gene were co-transfected into HEK293 cells with MZF1 overexpression plasmids. The luciferase activity was determined to screen the binding sites of MZF1. Results: PCR and nucleic acid sequencing confirmed that the luciferase reporter plasmids of rat RGC32 gene promoter (full length and each truncation) were successfully constructed. Co-transfection of pGL3-RGC32-FL and pIRES2-EGFPMZF1 into HEK293 cells revealed a significant increase in the promoter activity of RGC32 gene. However, the priming activity of pGL3-RGC32-FL32 / pGL3-RGC32-1 / pGL3-RGC32-2 and pGL3-RGC32-3 / pGL3-RGC3F1 / pIRES2-EGFP-MZF1 was significantly lower than that of pGL3-RGC32-FLPGL3-RGC32-1 and pGL3-RGC32-1, respectively, and the priming activity of pGL3-RGC32-FLP GL3-RGC32-1 and pGL3-RGC32-2was significantly lower than that of pGL3-RGC32-FL1 and pGL3-RGC32-1, respectively. These results suggest that MZF1 may bind to the -286nt -86 NT region of the RGC32 gene promoter. Conclusion: the full-length and truncated luciferase reporter plasmids of rat RGC32 gene promoter were successfully constructed. It was confirmed that overexpression of MZF1 could promote the initiation of RGC32 gene, and the possible binding region of transcription factor MZF1 on the promoter of RGC32 gene was preliminarily screened.
【作者单位】: 南京医科大学微生物与免疫学系;
【基金】:国家自然科学基金(31470853,81273333,81471626) 江苏省自然科学基金面上项目(BK20131386)资助
【分类号】:R692.31

【共引文献】

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本文编号:2020380

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