小分子RNA-30d通过靶向调控MYPT1促进前列腺癌进展和血管生成

发布时间：2019-01-12 13:19

【摘要】：研究背景及目的：目前,北美地区男性恶性肿瘤中,前列腺癌依旧是发病率最高的肿瘤,死亡率仅次于肺癌。尽管检测血清PSA早期筛查临床前列腺癌患者已得到更加广泛的应用,临床治疗前列腺癌有激素、手术、放射等有效治疗方法,但是,仍有许多前列腺癌患者最终都由于前列腺的进展而死亡。临床发现,通过早期筛查发现的高恶性程度的病例在及时的根治性切除术治疗,在短期内可能也会出现生化复发或临床转移。因此,这种类型的病例一般认为除了需要早期的确诊并且及时的根治性治疗外,术后接受辅助性的化疗或放疗也很有必要。然而,大部分的前列腺癌病例进展缓慢,甚至终生不发病,在临床上被认为是“惰性”的肿瘤。不少前列腺癌临床患者在长期的随访检查中出现PSA的升高,在这部分患者中大约有三分之一的患者在前列腺癌根治术术后几年内出现远处转移。临床上预测前列腺癌生化复发和转移的标志物主要有患者PSA水平、Gleason评分和影像学资料。但是,患者的临床诊断和预后与长期的临床筛查和随访检查的结果有时确是相反的,根据现有的临床预后标记物比如血清PSA水平、Gleason评分和病理分期有时也很难预测患者的预后。因此,我们迫切需要寻找更好的临床预后标记物来筛出需要进一步干预治疗的患者,并依此制定出更合适的治疗方案。小分子RNA (microRNAs, miRNAs)在由大约22个核苷酸构成,它们以碱基配对的方式与编码蛋白的mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合,引起靶标基因的转录抑制和mRNA降解。miRNA在正常组织和细胞分化、增殖和凋亡中起重要调节功能。在不同的恶性肿瘤中已发现miRNA的表达有改变,并且miRNA被认为是调控肿瘤进展的关键因子。超过50%的miRNA位于易损的基因结构域上,因此,miRNA在肿瘤细胞中容易扩增、缺失或变位。miRNA在肿瘤中的异常表达通常被认为是因为miRNA的生物合成出现异常、启动子甲基化的改变和转录因子的调控而引起miRNA基因合成受影响。部分miRNA被认为是促癌因子或抑癌因子,最新研究发现部分miRNA在前列腺癌中表达异常,并且影响前列腺癌的激素依赖性、增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡。众多miRNAs中,对于miR-30d在肿瘤中作用的研究是近几年miRNAs领域的热点。miR-30d已被证实了在多种恶性肿瘤中表达上调,并发挥关键的促癌作用,包括黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌和周围神经鞘瘤。证实了miR-30d可通过直接调控靶标基因的表达从而参与调控肿瘤细胞的生物学功能过程,例如细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭和血管生长等,参与肿瘤的发生和发展,并最终影响肿瘤的转归和预后。一般认为,miRNAs的生物学功能具有高度的组织和细胞特异性,miR-30d也不例外。研究证明,在黑色素瘤组织和细胞中,miR-30d表达明显上调并且可通过抑制靶标基因半乳糖胺转移酶GALNT7的mRNA表达,增加免疫抑制因子IL-10的表达,降低机体的免疫细胞活性和聚集,促进肿瘤的侵袭力和免疫抑制,最终诱导肿瘤发生转移。目前,miR-30d在前列腺癌细胞和组织中的基因表达和对肿瘤的生物学功能尚未完全清楚。本研究旨在探索miR-30d在前列腺癌中的作用及其调控的靶基因。材料：1.人临床组织来源：18对配对的原发性前列腺癌及癌旁良性前列腺冰冻组织从广州市第一人民医院组织库获得；Taylor I临床前列腺癌组织芯片数据库作为GEO的数据资源,其中前列腺癌组织miRNA表达谱芯片包含有详细临床随访数据的113个原发性前列腺癌病例；本研究所应用的包含225例人原发性前列腺癌组织和25例癌旁良性前列腺组织的前列腺组织芯片(Tissue microarrays,TMA),是美国麻省总医院(MGH)泌尿病理科所收集的1993年到1995年期间在接受前列腺癌根治术患者的前列腺组织。2.动物：20只年龄在4-5周的BALB/c雄性裸鼠购买于广东医学实验动物中心。3.细胞株：良性的前列腺上皮细胞株PrEC是从美国的Lonza公司购买获得。前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCaP都是于2012年从美国马纳萨斯州的美国菌种保藏中心(ATCC)公司购买。方法：1.通过利用慢病毒载体转染构建稳定miR-30d过表达和抑制表达DU145和LNCaP细胞株；核酸或质粒瞬时转染DU145和LNCaP构建靶基因MYPT1、 miR-30d和靶基因MYPT1同时过表达等细胞株。2.通过统计学方法分析Taylor临床前列腺癌组织miRNA芯片数据库中miR-30d的表达水平与前列腺癌患者的临床特征以及预后的相关性。3.细胞功能实验分析miR-30d在体外对前列腺癌细胞功能的影响,以及靶基因MYPT1能否拮抗miR-30d对前列腺癌细胞引起的效应,包括HUVEC细划痕实验、侵袭实验、管腔生成实验。裸鼠皮下接种DU145和LNCaP细胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析miR-30d在体内对前列腺癌成瘤和转移方面的影响。4.利用基因表达谱芯片技术对过表达miR-30d和NC对照的LNCaP和DU145细胞株进行基因表达谱分析,获得一批miR-30d调控的差异表达基因。利用生物信息学软件IPA和GO功能分析差异基因相关的信号通路、生物学功能和疾病。5.通过利用Target-Scan、miRWalk和miRanda等miRNAs靶基因预测软件预测miR-30d调控的潜在靶基因；荧光素酶报告系统验证miR-30d直接调控的靶基因。6. qRT-PCR检测miR-30d过表达和空白对照的LNCaP细胞株中候选靶基因CALD1、TNPO1、ATP2B1、SEPT7、MYPT1、ZNF148、CEP350、KIF5B、 STAG2和GALNT1的表达水平。qRT-PCR分别检测前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCaP,正常前列腺上皮细胞株PrEC,以及18对前列腺癌和对应的癌旁良性前列腺组织的miR-30d的表达水平。通过统计学方法分析Taylor I临床前列腺癌组织miRNA芯片数据库中miR-30d与MYPT1的mRNA表达的相关性。7.蛋白质印迹法检测miR-30d异常表达的DU145和LNCaP细胞株以及裸鼠皮下移植瘤组织中靶基因MYPT1和VEGF的蛋白水平；蛋白质印迹法检测靶基因MYPT1表达异常的相关细胞株构建是否成功；蛋白质印迹法检测miR-30d表达升高或MYPT1表达抑制的DU145和LNCaP细胞中MYPT1下游作用蛋白总cJUN、磷酸化cJUN (ser63)、磷酸化cJUN (ser73)和VEGF的蛋白表达水平。8.免疫组织化学分析MYPT1和免疫荧光分析CD31在前列腺临床组织芯片中的表达情况；免疫组织化学分析miR-30d异常表达的DU145和LNCaP细胞株接种形成的裸鼠皮下肿瘤组织中CD31和MMP-9的表达情况。统计学处理：数据统计分析用SPSS17.0统计软件包处理。利用Pearson卡方检验分析计数资料。采用Kolmogorov-Smirnov (K-S)检验评估Taylor临床前列腺癌组织芯片数据库中miR-30d的基因表达水平分布的正态分布性。定量资料结果采用两独立样本t检验分析(qRT-PCR、免疫组化、白质印迹法和细胞功能实验)。Taylor临床前列腺癌组织芯片数据库中的miR-30d基因表达水平和前列腺癌患者临床特征之间的关系采用两独立样本t检验和One-way ANOVA检验。比较不同时间点的两组数据之间差异采用重复测量方差法。前列腺癌患者临床生存分析采用Kaplan-Meier方法及log-rank检验,评估miR-30d、MYPT1和CD31以及MYPT1和CD31共表达能否成为前列腺癌预后的独立预测指标采用COX回归模型单因素和多因素分析。临床前列腺癌组织标本中miR-30d和MYPT1基因表达量之间的相关性采用Pearson相关性分析。连续变量以X±s的形式展示。P0.05为差异具有统计学意义。结果：1.相对正常前列腺上皮细胞株PrEC, miR-30d在PC3、DU145和LNCaP细胞株中的表达量均显著性上调(P0.001); miR-30d在人临床前列腺癌组织中的表达量相对于癌旁良性前列腺组织的表达量同样显著性下调(P=0.040)。2.利用Taylor I临床前列腺癌组织miRNA芯片数据库分析显示miR-30d的基因表达水平与患者术前PSA水平、Gleason评分、临床分期和病理分期存在正相关关系(P值分别为0.003、0.01、0.007和0.004),miR-30d基因的上调表达与前列腺癌患者术后发生远处转移和生化复发正相关(P=0.001,0.002),然而,miR-30d的表达水平与患者的年龄和是否死亡不存在显著的相关性(P0.05)。Kaplan-Meier和Log rank方法显示miR-30d高表达组患者术后的总体生化复发生存率和总体生存率显著性增加(P0.001和P=0.041)。COX回归单因素分析结果提示患者肿瘤病理分期[HR：5.32(2.36-11.99)]、Gleason评分[HR：10.765(4.896-23.669)]和miR-30d表达水平[HR：3.834(1.615-9.102)]可能为评估前列腺癌患者术后生化复发风险的预测因子,而患者年龄、术前血清PSA水平、肿瘤临床分期并不是评价前列腺癌预后的预测因子。利用COX回归模型多因素分析,结果提示miR-30d基因表达水平[HR：3.510(1.387-8.878)]、Gleason评分[HR：7.433(2.941-18.784)]和病理分期[HR：3.175(1.172-8.600)]能够作为预测前列腺癌根治术后生化复发风险的独立指标。3.体外细胞功能实验显示miR-30d过表达的DU145和LNCaP细胞株的增殖、迁移、侵袭和促进血管内皮细胞微管生成能力相对空白对照组明显增强(P0.05)。相反,miR-30d抑制表达的DU145和LNCaP细胞株的增殖、迁移、侵袭和促进血管内皮细胞微管生成能力相对对照组明显减弱(P0.05)。4.裸鼠皮下种植瘤模型显示miR-30d过表达能够显著性促进由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生长速度(P0.05)；相反,miR-30d的表达被抑制后移植瘤成瘤大小比对照组小,且生长速度减慢。免疫组化分析结果显示miR-30d能够显著性促进移植瘤组织中新生血管指标CD31和肿瘤侵袭力指标MMP-9的表达水平(P0.05)。5.基因表达谱芯片发现的差异性表达蛋白总共有1420个,有116个基因同时在LNCaP和DU145细胞株中的差异表达的倍数≤-2或≥2(miR-30d vs miR-NC),包括3个上调基因和143个下调基因。IPA生物信息软件的KEGG通路分析显示大部分下调的差异基因参与了肿瘤相关的通路,其中包括RAN信号通路(RAN Signaling)、RhoA信号通路、蛋白泛素化酶信号通路、HIF1-a信号通路和肾细胞癌信号通路。IPA生物信息软件的生物学功能和相关疾病分析结果显示下调表达的差异基因参与了细胞功能形态、细胞运动等肿瘤进展相关的生物学功能。6.3个miRNAs靶基因软件共同预测116个LNCaP和DU145细胞株共同下调的基因中可能被miR-30d调控的候选靶基因,结果显示CALD1、TNPO1、 ATP2B1、SEPT7、MYPT1、ZNF148、CEP350、KIF5B、STAG2和GALNT1为候选靶基因。qRT-PCR结果显示MYPT1、CEP350、STAG2和GALNT1在稳定表达miR-30d的LNCaP和DU145细胞株中表达显著性下调(P0.05)在miR-30d过表达的LNCaP细胞株和裸鼠皮下移植瘤组织中表达下调(P0.05)。荧光素酶报告系统进一步揭示MYPT1是miR-30d直接调控的靶基因(P0.001)。qRT-PCR和白质印迹法证实miR-30d和MYPT1在前列腺癌细胞株和裸鼠皮下种植瘤的基因和蛋白表达存在负相关的关系；在Taylor临床前列腺癌组织芯片数据库中两者的基因表达水平也呈负相关的关系。7.体外细胞功能实验示MYPT1过表达可以拮抗miR-30d在前列腺癌细胞中产生的HUVEC细胞迁移、侵袭和管腔生成能力的促进作用(P0.05)。这些结果进一步揭示了MYPT1可能是miR-30d发挥促进前列腺癌进展作用下游重要的媒介。8.组织芯片免疫染色分析显示前列腺癌组织标本的MYPT1免疫评分显著低于癌旁良性前列腺组织(P0.001)；MYPT1的低表达与前列腺癌患者的Gleason评分较高(P=0.002)、转移(P=0.018)、生化复发(P0.001)和总体生存率降低(P=0.005)有关。Kaplan-Meier法和Log rank法分析结果显示MYPT1的低表达与患者总体无生化复发生存率、总体生存率降低、无转移生存率的降低有关(P值分别为0.001、0.005和0.049)。COX回归模型显示MYPT1可作为预测前列腺癌患者无生化复发生存率和无转移生存率的独立指标,HR(95%CI)分别是3.339(1.962-5.684)和2.169(0.752-6.260)。同一套芯片上行CD31免疫荧光分析结果显示MYPT1在前列腺癌组织中的表达与CD31呈负相关关系(RS=-0.457,P0.001),采用Kaplan-Meier法和Logrank法分析,结果显示MYPT1低表达同时CD31高表达与患者无生化复发生存率、总生存率降低、无转移生存率的降低相关(P值分别为0.001、0.017和0.008)。COX回归模型多因素分析显示MYPT1低表达/CD31高表达是患者无生化复发生存率独立指标,HR(95%CI)为0.366(0.183-0.734),但不能成为无转移生存率独立的预后因子。9.在前列腺癌细胞株LNCaP和DU145中,抑制MYPT1的表达或miR-30d过表达均可以同时导致磷酸化cJUN (ser63)、磷酸化cJUN (ser73)和VEGF的蛋白水平升高,而总cJUN的蛋白水平无明显变化,这结果说明cJUN磷酸化激活引起的VEGF表达增加是miR-30d-MYPT1轴影响前列腺癌血管生成的下游重要信号通路。结论：1.在前列腺癌中,miR-30d作为促癌基因,可通过靶标调控抑制MYPT1的表达促进肿瘤的进展。2. miR-30d和MYPT1均可作为预测前列腺癌患者根治术后生化复发风险的独立预测指标；MYPT1还可作为前列腺癌患者根治术后转移的独立预测指标。3. MYPT1在临床前列腺癌中的表达与CD31负相关,miR-30d通过靶向抑制MYPT1的表达促进前列腺癌血管生成,促进前列腺临床进展和转移。4. miR-30d-MYPT1信号轴对cJUN-VEGF的调控有望成为临床治疗前列腺癌的新靶标。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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