Kat7在肾癌中的功能及机制研究

发布时间：2019-03-11 13:19

【摘要】：目的:肾癌,是全球十大恶性肿瘤之一,居泌尿系统第二大肿瘤疾病,该疾病的全球发病率和死亡率每年上升2%-3%。它主要来源于肾实质,以透明细胞癌最为常见,其占所有肾癌类型的75-80%。早期肾癌无症状且不易被发现,晚期肾癌患者可出现患者出现腰痛、血尿、腹部包块等症状。在诊断为肾癌的所有患者中,20-30%患者已出现远处转移,这些患者在行手术治疗后仍有30%比例患者出现疾病进展。但是如果在疾病早期能够发现肾癌并进行干预,患者的5年生存率可以达到90%。目前,已报道的几种肾癌相关预测因子,由于其个体异质性及测定敏感度等方面的原因并无法广泛引用于临床中,因此寻找肾癌治疗的新靶标及肿瘤预测因子,成为近年来的主要研究热点。组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)是乙酰化重要的功能蛋白酶,它能把乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白N端特定的赖氨酸残基上,又被称为赖氨酸乙酰基转移酶(lysine acetyltransferase,Kat)。Kat7(lysine acetyltransferase 7,Kat7)作为组蛋白乙酰转移酶的一个亚基,参与细胞内的复杂的生物学功能,包括基因转录、DNA损伤修复、细胞凋亡等。作为HATs家族的一份子,Kat7是多种蛋白复合物的催化亚基,其中包括肿瘤抑制蛋白Ing4/5、JADE-1蛋白等,并能乙酰化组蛋白H4,也能作为Cdt1的共激活子参与复制起始调节;尤其是Kat7在DNA复制起始中可能作为复制因子Cdt1的共刺激因子起作用,Kat7也对细胞复制周期中的S期起重要作用。Kat7在多种原发癌中表达增加,包括乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌及前列腺癌等。但是Kat7在肾癌中的尚未有明确报道,且对其肿瘤发生、发展过程的分子机制尚缺乏一定的认识。内容:首先,我们对肾癌患者病理标本进行Kat7检测,分析并统计其临床意义;其次,通过对Kat7进行体内外实验研究,探究Kat7对肾癌生长的影响;最后,通过研究Kat7与细胞周期蛋白cyclin B1的关系,寻找该分子调控肾癌生长的部分机制。方法:首先,通过免疫组化及预后生存曲线分析Kat7与肾癌患者预后关系;其次,分别利用生长曲线、克隆形成实验及裸鼠成瘤实验,研究Kat7对肾癌生长的影响;最后,采用RT-PCR、免疫共沉淀实验、蛋白免疫印迹实验、蛋白酶体抑制等实验,研究Kat7对cyclin B1之间的调控作用。结果:首先,我们利用免疫组化对本单位收集的55名肾癌患者病理标本进行检测,Mann-Whitney U秩和检验比较癌组织和癌旁组织间Kat7表达差异,结果表明肾癌与癌旁正常组织中Kat7的表达量存在差异,且肾癌组织中Kat7的表达量高于癌旁组织,差异具有统计学意义;通过Kaplan-Meier生存曲线分析可知Kat7表达越高的肾癌患者无疾病生存期及总生存期越短。其次,在体外细胞实验中通过转染慢病毒包装质粒p CDH-Kat7构建的稳定786-O肾癌细胞克隆,与其对照组肾癌细胞比较,CCK8结果说明转染p CDH-Kat7质粒的786-O细胞组增殖能力上升,克隆形成实验说明转染p CDH-Kat7质粒的786-O肾癌细胞集落数较对照组明显增多;而且通过比较敲除Kat7的Caki-1细胞与其裸细胞,生长曲线提示敲除Kat7的肾癌细胞Caki-1生长受到抑制。为进一步分析Kat7与肾癌细胞生长之间的关系,我们分别利用慢病毒过表达Kat7的786-O稳定克隆及敲除Kat7肾癌细胞Caki-1与它们各自的对照细胞比较,通过流式细胞仪分析说明了Kat7的表达能够促进肾癌细胞由G2期到M期的转换,从而促进肾癌细胞的增殖,蛋白免疫印迹实验提示Kat7的过表达促进cyclin B1蛋白的表达;反之,Kat7敲除能够抑制Caki-1细胞由G2期过渡到M期,最终阻滞了Caki-1细胞的生长增殖。为深入研究Kat7与cyclin B1在细胞内的相互作用,我们用Myc空载体质粒及Myc-Kat7质粒分别与Flag-cyclin B1共同转染入293T细胞,收集细胞裂解物分别与Myc-beads偶联,进行免疫共沉淀行Western blotting检测发现Myc-Kat7蛋白能被G2/M期的cyclin B1特异性富集。为进一步探索了Kat7与cyclin B1蛋白之间的直接相互作用,我们通过纯化GST-cyclin B1融合蛋白,与转染Myc-Kat7的786-O及Caki-1细胞裂解产物孵育,通过GST pull-down实验发现Kat7蛋白与cyclin B1在体外具有直接且特异的相互作用。接下来为明确Kat7基因调控cyclin B1的具体机制,我们通过RT-PCR技术验证Kat7对cyclin B1的调控,收取Kat7过表达样品,将其一分为二,其中一份样品通过蛋白免疫印迹实验验证Kat7的蛋白表达,另外一份样品通过提取RNA,并进行反转录合成c DNA,最后通过RT-PCR仪检测过表达Kat7及其与对照组cyclin B1的m RNA含量,与对照组比较,高表达Kat7组中cyclin B1的m RNA水平保持一致,差异没有统计学意义;同理,敲低Kat7的Caki-1肾癌细胞样品中的m RNA水平与对照组没有统计学差异。为进一步验证Kat7蛋白对cyclin B1的蛋白具有降解作用,通过比较正常对照细胞与敲低Kat7的786-O及敲除Kat7的Caki-1肾癌细胞中cyclin B1蛋白的表达,收取细胞裂解产物,加入蛋白合成抑制剂的放线菌酮实验,在不同时间点收取细胞裂解产物,Western blotting检测结果说明敲低Kat7的786-O细胞周期蛋白cyclin B1的半衰期缩短。为研究Kat7参与cyclin B1蛋白降解的作用方式,分别收取Kat7敲低的786-O及敲除Kat7的Caki-1的细胞裂解物,其中一组样品在收取细胞裂解产物之前加入蛋白酶抑制剂MG132作用后,通过Western blotting检测cyclin B1蛋白,结果说明蛋白酶抑制剂能够抑制Kat7对cyclin B1蛋白的降解。为验证Kat7的体内对肾癌细胞生长的影响,通过裸鼠成瘤实验发现敲除Kat7的Caki-1细胞植入裸鼠体内的肿瘤形成能力明显弱于对照组动物肾癌肿瘤模型动物。结论:Kat7在肾癌中的表达高于癌旁,且与预后呈负相关;Kat7能够通过泛素蛋白酶体途径调控cyclin B1周期蛋白,进而调控肾癌生长。本实验说明Kat7在肾癌的发生中发挥重要作用,该基因很可能成为新的预预测因子及治疗靶点,通过针对该靶点药物的研发,抑制该基因的表达,从而抑制肾癌细胞的生长,这将为将来肾癌的治疗提供新的治疗策略。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.11
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本文编号：2438311