新型接头蛋白XB130促进前列腺癌演进的初步研究

发布时间：2019-08-02 08:38

【摘要】：研究背景和目的前列腺癌是发生在前列腺上皮的恶性肿瘤。其发病率在男性恶性肿瘤中居第二位,在欧美等西方发达国家,前列腺癌在男性肿瘤中发病率最高。近年来,我国前列腺癌发病率稳步升高,发病年龄日趋年轻化。已跃居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的前三位。但其发生、发展机制仍未阐明。由于前列腺癌起病隐匿,早期无明显症状,往往在例行健康检查或抽血筛检时,因前列腺癌特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)值升高后进行进一步检查才确诊。但目前研究和临床实践观察到PSA特异性不强,多种原因可导致PSA升高。前列腺癌的诊断参考指标Gleason评分,判断前列腺癌患者预后及治疗方案的重要参考因素,病理评分偏差会影响治疗方案的选择,寻找新的诊断指标具有紧迫性和重要意义。大多数早期前列腺癌是雄激素依赖型的,对内分泌治疗敏感,但一般经抗雄激素治疗12-18个月后转为雄激素非依赖型前列腺癌(Androgen Independent Prostate Cancer, AIPC),对内分泌治疗耐受,患者在雄激素去除后肿瘤仍不断增殖,病情进展恶化,最终导致患者死亡。AIPC患者的生存期一般不超过18个月.因此前列腺癌的防治仍是一个难题,阐明前列腺癌发生的分子机制,能更好地理解前列腺癌这种复杂的肿瘤生物学行为,从而建立有效的检测手段,防止和延缓前列腺癌的进一步发展。近年来研究显示,PI3/AKt信号途径对雄激素非依赖性前列腺癌的发生起重要作用,其信号传导通路抑制剂可应用于前列腺癌的治疗。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)是一种广泛分布在细胞的磷脂酰肌醇激酶,参与调解多种细胞信号通路,调控细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能,其活性的增加常与多种癌症相关。蛋白激酶B (Protein KinaseB, PKB/Akt)是20多年前发现的一种v-Akt原癌基因的同源物。生长因子受体配体相互作用后激活P13K,活化的P13K使PIP2磷酸化为PIP3,然后PIP3协同PDK1使Akt完全磷酸化而激活。PTEN可使PIP3去磷酸化为PIP2,因而拮抗了PIP3的作用,研究发现,在30%-50%的前列腺癌中常因PTEN的丧失,诱发PI3K/Akt信号转导通路发生上调而导致肿瘤的发生发展。肌动蛋白丝相关蛋白AFAP (actin filament associated protein)是一种小型的接头蛋白家族,参与细胞内信号转,细胞骨架的构成,可直接激活c-Src,并通过调节机械牵张诱导c-Src的活性。克隆人类AFAP (hAFAP)的过程中,Hann等发现了一种新型接头蛋白,命名为AFAP1L-2(actin filament associated protein1-like2),位于染色体10q25.3,编码一种818个氨基酸组成的蛋白质,因为分子量大小是130kDa,所以也叫XB130。文献报道,XB130作为一种新型接头蛋白,在信号转导的调控中起重要作用,影响细胞增殖,存活,运动和侵袭。 XB130的沉默导致甲状腺癌细胞增殖、迁移能力降低,异体移植瘤的生长速度减慢,提示XB130在甲状腺癌中为促癌作用。在胃癌发生发展中,XB130为促癌作用,但在5-FU治疗的胃癌过程中,高表达XB130患者对5-FU的敏感性增强,从而导致生存率的提高,高表达XB130可能是是胃癌预后高生存率和低复发率的一个诊断标志物。这样矛盾的基因差异并不少见,如低表达的癌基因Bc1-2和Bcl-13为胃癌预后的不良因素,而抑癌基因p53的过量表达会降低整体生存率。最新研究表明,在胰腺导管癌中,XB130高表达与胰腺导管癌分级成正相关。XB130在细胞质弥漫性分布,具有信号传导的作用,并且细胞粘附需要肌动蛋白丝相关蛋白(AFAP)形成肌动蛋白纤维,这也是前列腺癌的致瘤生长的关键。但在前列腺癌中未有任何报道。方法 1.组织芯片技术分析XB130蛋自在人体正常组织和恶性肿瘤组织中的表达自行设计并制作组织芯片,包括多器官常见癌11种,每种3—5例,癌/正常各1点,生殖系统癌4种,每种3—10例,癌/正常各1点。免疫组化方法检测XB130蛋白在人体正常组织和常见恶性肿瘤组织及生殖系统癌与正常组织中的的分布和表达。 2.XB130蛋白在前列腺癌组织中的表达及临床意义应用免疫组化 EnVisionTM二步法检测XB130蛋白在210例带随访资料的前列腺癌组织中的表达情况；应用SPSS13.0软件进行统计学处理,采用x2检验分析XB130蛋白表达水平与各临床病理参数之间的关系；采用Kaplan-eier法回顾性分析XB130蛋白表达与前列腺癌患者生存期的关系；以COX回归对各项指标单因素或多变量联合与生存期的关系进行统计学分析。 3.XB130基因表达沉默对前列腺癌细胞生物学特性的影响应用荧光定量PCR、Western blot等方法检测22RV1、LNCap、DU145、PC3等4株前列腺癌细胞株中的XB130基因/蛋白的表达情况。利用在线数据库和软件设计XB130基因干扰片段,用含有XB130基因干扰片段的慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度测定。用慢病毒感染前列腺癌细胞株DU145. LNCap细胞,含空载体的病毒做对照。Western blot检测细胞干扰效率。利用CCK8法、平板克隆形成实验检测XB130基因沉默后对前列腺癌细胞体外增殖的影响；流式细胞术分析XB130基因沉默后对前列腺癌细胞周期的影响；Transwell对XB130基因沉默后对前列腺癌细胞体外运动迁移能力的影响；裸鼠皮下成瘤实验在体内进行验证。 4.XB130对前列腺癌作用的可能机制的初步探讨通过Western-blot检测AKT通路上的位点,观察XB130是否通过AKT通路影响前列腺癌的发生发展。通过Western Blot检测E-cadherin和Vimentin,观察其是否产生EMT样改变,从而促进前列腺癌细胞增殖和侵袭结果 1.组织芯片技术分析XB130蛋白在人体正常组织和恶性肿瘤组织和生殖系统肿瘤中的表达判读统计两张芯片的实验结果,15种正常人组织中在胃粘膜、肾皮质组织、甲状腺组织中高表达,肺泡上皮、子宫内膜中未见XB130蛋白阳性表达,其余组织均为中～低表达。常见18种肿瘤组织及生殖系统肿瘤中,除子宫颈鳞状细胞癌XB130为阴性,其余肿瘤组织中胰腺导管腺癌、前列腺腺癌、乳腺浸润性导管癌、乳腺浸润性小叶癌、乳腺导管原位癌、卵巢间变型无性细胞瘤等肿瘤存在肿瘤细胞XB130蛋白高表达；甲状腺乳头状癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肝细胞性肝癌、肾透明细胞型肾癌、肺鳞状上皮癌、肺腺癌、食管鳞状细胞癌、卵巢浆液性乳头状腺癌、卵巢囊腺癌等肿瘤可见肿瘤细胞XB130蛋白低表达。 2.XB130蛋白在前列腺癌组织中的表达及临床意义免疫组化检测结果显示XB130蛋白在200例前列腺癌组织中的总阳性表达率为85.6%。前列腺癌组织中各级表达所占比例分别为：“-”占14.28%(30/210),“+”占26.19%(55/210),“++”占35.71%(75/210),“+++”占23.81%(50/210)。XB130蛋白表达水平与前列腺癌患者PSA、f-PSA、肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加及Gleaseon评分高低相关。随访发现,XB130蛋白高表达前列腺癌患者生存时间低于XB130蛋白低表达患者,差异有统计学意义(P=0.0121)。将XB130蛋白表达和临床病理参数综合与前列腺癌患者的生存时间Cox风险分析,结果显示高表达XB130为影响前列腺癌预后的独立因素(P=0.0376)。 3.XB130基因在前列腺癌细胞中的表达及干扰XB130后对前列腺癌细胞生物学特性的影响采用荧光定量PCR法检测4种人前列腺癌细胞株中XB130基因的表达情况。单因素方差分析的结果表明：4种细胞株中XB130基因的表达差异具有显著性(F=92.752, P0.01), XB130基因在DU145前列腺癌细胞中的表达水平明显高于正常前列腺上皮细胞中的表达水平,差异具有统计学意义。另外三种前列腺癌细胞中,LNCap细胞中XB130基因表达较高。Western blot检测结果显示,前列腺癌细胞株中阳性表达与荧光定量PCR结果一致。构建了XB130的慢病毒干扰载体,包装慢病毒后感染DU145和LNCap细胞,利用Western blot技术检测各干扰片段XB130的表达情况,筛选干扰效率最高的片段A(90%)为下一步实验的研究对象(命名为DU145/XB130-、 LNCap/XB130-细胞)。CCK8法观察XB130基因表达沉默后体外细胞的增殖情况,与DU145/mock细胞相比,DU145/XB130-细胞的增殖速度明显减慢(F=43.756, P=0.000), LNCap/XB130-与LNCap/mock相比也显著减慢(F=32.988,P=0.000)。平板克隆形成实验也显示DU145/XB130-细胞的活力显著下降(F=96.563, P=0.000), LNCap/XB130-细胞活力也显著降低(F=91.952,P=0.000)。利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的变化,结果显示DU145/XB130-细胞和LNCap/XB130-细胞G1-S期的比例减少(P分别为：0.03,0.02)表明XB130基因表达沉默后细胞增殖缓慢。综合结果表明XB130基因表达水平减低后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制。Transwell实验检测XB130基因沉默后对前列腺癌细胞体外运动迁移能力的影响。实验结果显示：DU145/XB130-、LNCap/XB130-细胞迁移数明显低于DU145/mock与LNCap/mock,差异具有显著性(F=85.678,P=0.000)。表明XB130沉默后细胞的的运动迁移能力较弱。体内实验,裸鼠皮下成瘤结果显示,与对照组细胞相比DU145/XB130-和LNCap/XB130-两组处理组细胞的裸鼠成瘤速度显著减慢,差异有统计学意义P值分别为DU145/XB130-(P0.01), LNCap/XB130-(P0.001),提示干扰XB130基因后,DU145和LNCap细胞在裸鼠体内的生长速度显著降低。 4.XB130促进前列腺癌细胞增殖和侵袭机制的初步探讨通过Western Blot对沉默掉XB130的细胞检测结果显示,AKT通路相关磷酸化指标p-PDK1、p-c-Raf, Thr308降低,p-PTEN升高而总AKT不变。结果表明XB130是通过AKT信号通路调控前列腺癌。之后通过Western Blot检测E-cadherin和Vimentin,我们发现沉默掉XB130后E-cadherin增高, Vimentin降低。表明XB130参与Akt磷酸化和EMT样改变,从而促进前列腺癌细胞增殖和侵袭。结论 1.XB130蛋白在多种肿瘤组织中高表达,表明XB130可能是导致肿瘤发生发展的重要分子； 2.XB130蛋白高表达结合临床随访资料分析,表明高XB130与患者生存时间密切相关,提示XB130可作为前列腺癌预后判断的重要指标,对判断前列腺癌预后有重要意义； 3.检测XB130蛋白在前列腺癌细胞株DU145和LNCap中高表达,22RV1和PC3中低表达,考虑与细胞来源不同相关。XB130基因沉默,抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭、转移。 4.XB130参与Akt磷酸化和EMT样改变。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【参考文献】