和厚朴酚抗膀胱肿瘤的机制研究

发布时间：2020-01-24 06:25

【摘要】：目的:对于非肌层浸润性膀胱癌,不论是术后免疫治疗还是局部化疗,其高复发率和高进展率依然是泌尿外科领域难以解决的问题,且大多药物毒副作用十分明显,使患者承受着巨大的痛苦。如患者条件允许,符合手术适应症,肌层浸润性膀胱癌患者多数会选择根治性膀胱切除术,术后予以辅助性全身化疗,现应用于膀胱癌全身化疗的药物主要是铂类为主的化疗药物,然而,此类化疗药物因其副作用明显,耐药性等问题威胁着临床中肌层浸润性膀胱癌的治疗。因此,能够寻找出一种毒副作用小,作用效果明显且不易产生耐药或者能够逆转耐药的的药物已迫在眉睫。和厚朴酚是传统中药厚朴的提取物,在体内及体外实验均证实其具有良好的抗肿瘤作用,且毒副作用很低,其在膀胱癌中研究也有报道,但研究尚浅。本研究用不同浓度的和厚朴酚处理膀胱癌细胞(T24及EJ),观察和厚朴酚对膀胱癌细胞的增殖抑制情况,促进凋亡及抑制血管生成等生物学行为的影响,并尝试探讨和厚朴酚抗膀胱癌的作用机理。方法:体外培养对数生长期的膀胱癌T24和EJ细胞,并用不同浓度的和厚朴酚进行处理。首先用肉眼观察不同处理组的肿瘤细胞的数量变化,确认有效果后进行后续试验。MTT和单克隆形成试验观察细胞的增殖情况,同时用MTT法筛选出药物的最佳处理浓度。用流式细胞术检查和厚朴酚对T24,EJ细胞周期和凋亡的影响,用PCR筛选周期,凋亡,增殖及血管生成等相关蛋白的mRNA的表达水平,肿瘤细胞的增殖,凋亡,周期蛋白的表达情况采用Western blot实验及Caspase相关试剂盒检验并推测和厚朴酚抗膀胱癌可能的相关通路。结果:1、MTT结果:和厚朴酚处理膀胱癌细胞T24和EJ细胞后,两种肿瘤细胞均呈现增殖抑制现象,且这种现象呈现时间剂量依赖性。单克隆形成试验表明,和厚朴酚对膀胱癌T24细胞单克隆的形成具有明显的抑制作用,且此作用呈现出剂量依赖性。2、流式细胞术结果:用不同浓度的和厚朴酚(0ul,20ul,40 ul,60 ul)处理膀胱癌T24和EJ细胞48h后,我们发现随着和厚朴酚浓度的增高,两种肿瘤细胞的周期抑制效果越明显,并且T24和EJ细胞大多被抑制在G1期向S期转化(即抑制肿瘤细胞的有丝分裂)。同样方法处理上述肿瘤细胞后,随着和厚朴酚浓度的增高,两种细胞的凋亡细胞所占比例逐渐升高,且呈现剂量依赖效应。3、PCR检测结果:搜集不同浓度和厚朴酚处理细胞的总RNA并将其反转录成cDNA后检测周期,凋亡,增殖,血管生成等相关基因在mRNA水平的变化情况,显示和厚朴酚作用后的肿瘤细胞中PCNA,CDK-4,CDK-6,BCL-2,MCL-1,VEGF的mRNA水平明显下降;Bad,Bax,Bak的mRNA表达量明显上升。以上结果显示,和厚朴酚能够明显抑制膀胱癌T24和EJ细胞的增殖作用(周期抑制),诱导T24和EJ细胞的凋亡,和抑制肿瘤血管的生成。4、Caspase-3、8、9检测结果:用不同浓度的和厚朴酚(0ul,20ul,40 ul,60 ul)处理膀胱癌T24和EJ细胞,发现随着和厚朴酚药物浓度的增加,Caspase-3、8、9的表达量逐渐增加,这种浓度增加的现象呈现出时间剂量依赖效应,表明和厚朴酚诱导膀胱癌T24和EJ细胞的凋亡。并且这种凋亡呈现出Caspase依赖的途径。5、Western-blot结果显示:和厚朴酚能够抑制CDK-4,CDK-6,BCL-2蛋白的表达,能够增强Bax蛋白的表达,且呈现剂量依赖关系,进一步验证上述结果。结论:和厚朴酚能够抑制膀胱癌T24及EJ细胞的增殖,其抑制增殖的主要机理是肿瘤细胞大多被抑制在G1/S期的节点上,表明和厚朴酚能够阻止肿瘤细胞G1期向S期转化,抑制肿瘤细胞的有丝分裂;和厚朴酚能够通过诱导Caspase依赖途径和Caspase非依赖途径导致膀胱癌细胞T24及EJ细胞的凋亡。在者,和厚朴酚不仅通过内源性途径影响膀胱癌T24及EJ细胞的凋亡,还通过外源性途径影响肿瘤细胞的凋亡;和厚朴酚能够抑制膀胱癌T24及EJ细胞的血管的生成。总之,和厚朴酚具有良好的抗膀胱癌肿瘤细胞的效果,其能够从多种方面抑制膀胱癌肿瘤细胞,但仍需深入的去探讨相关的通路以期为临床的应用提供更加充分的理论依据。
【图文】：

细胞活力,膀胱癌,细胞,抑制效果

结果2.1 MTT 法检测不同浓度（0uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkiol 作癌 T24 和 EJ 细胞后细胞的增殖情况2.1.1 应用不同浓度（0 uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkiol 作癌 T24 细胞 24、48、72h 后，经酶标仪测出各组的 OD 值，利用公式活力，结果显示各组的细胞活力表现出明显差异（p＜0.05），表明 H膀胱癌 T24 细胞的增殖具有明显的抑制作用，这种增殖的抑制效果与量正相关（如图 2.1，，表 2.1）。

活力,细胞活力,抑制效果,抑制作用

2.1.2 应用不同浓度（0 uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkio癌 EJ 细胞 24、48、72h 后，经酶标仪测出各组的 OD 值，利用公式力，结果显示各组的细胞活力表现出明显差异（p＜0.05），表明胱癌 EJ 细胞的增殖具有明显的抑制作用，这种增殖的抑制效果与时相关（如图 2.2，表 2.2）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.14

【参考文献】