次氯酸修饰白蛋白对肾脏纤维化大鼠线粒体功能的影响及抗氧化肽SS-31的保护作用

发布时间：2020-01-25 20:36

【摘要】：研究背景肾脏纤维化是几乎所有慢性肾脏病(CKD)的最终归宿,影响肾脏纤维化的原因有很多,其中氧化应激在肾脏纤维化的发生发展过程中起到了关键作用。氧化应激即活性氧簇(ROS)的产生和清除失衡,线粒体作为ROS产生的主要部位,更容易受到ROS的攻击而出现损伤,引起线粒体功能障碍,进而导致一系列疾病。目前己有许多研究证明线粒体功能障碍与多种肾脏疾病如糖尿病肾病、梗阻性肾病、缺血-再灌注肾损伤模型密切相关,但是线粒体功能障碍加重慢性肾脏纤维化的内在机制还不是十分清楚,在此次研究中,我们探讨次氯酸修饰白蛋白(HOCl-alb)在慢性肾衰竭大鼠模型中介导氧化应激和纤维化反应方面的作用和机制。研究方法32只雄性SD大鼠行5/6肾脏切除术后随机分为四组,每组8只,分别处理如下:(1)磷酸盐缓冲液(PBS),尾静脉注射与HOCl-RSA等体积量;(2)次氯酸修饰白蛋白(HOCl-RSA)20mg/kg,尾静脉注射,隔日一次;(3)抗氧化肽SS-313mg/kg,腹腔注射,每日一次;(4)同时注射HOCl-RSA及SS-31,隔日一次;另设假手术组(n=8)为对照组。于第13周将各组大鼠放置入代谢笼留取24小时尿量后处死动物,留取血液及肾组织进行后续检测。检测各组大鼠血肌酐(Scr),尿素氮(BUN),尿肌酐(Ucr)量,24小时尿蛋白定量(Up),计算肌酐清除率(Ccr);光镜下观察肾小球及肾间质纤维化程度并计算评分比较;新鲜肾组织提取线粒体后检测线粒体膜电位(MMP),以及肾皮质匀浆中ATP含量及线粒体活性氧(mtROS)含量;检测各组大鼠血浆及肾组织匀浆中HOCl-alb含量,锰SOD(MnSOD)活性等氧化应激相关指标;免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏巨噬细胞(ED-1阳性细胞)浸润数量、转化生长因子-1(TGF-β 1)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)水平的表达并计算各组评分后比较。蛋白质印迹法(WestemBlot)法检测各组大鼠肾脏线粒体及胞浆蛋白细胞色素C(Cyto C)水平,以及TGF-β 1、COL-Ⅰ、MCP-1、α-SMA水平的表达。经肾皮质提取RNA后反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测各组大鼠线粒体DNA(mtDNA)复制数量、TGF-β 1、COL-Ⅰ、MCP-1、α-SMA水平的表达。结果与对照组相比,5/6肾脏切除大鼠出现线粒体功能障碍,具体表现为MMP下降,ATP生成减少,mtDNA复制数量减少,Cyto C从线粒体的释放增加,MnSOD活性下降,以及大量产生的mtROS。血浆以及肾组织中HOCl-alb水平显著升高,同时伴随着细胞外基质的明显沉积,大量出现的蛋白尿,恶化的肾功能;炎症指标方面巨噬细胞浸润数量增加,MCP-1表达增多,纤维化指标如TGF-β1、COL-Ⅰ、α-SMA表达水平也明显升高。注射HOCl-RSA后显著加重了上述指标的变化,而注射线粒体靶向抗氧化肽SS-31后大鼠肾脏各项病理指标均明显改善。结论HOCl-alb 水平的升高可能导致肾脏的炎症及纤维化,并且可能与线粒体氧化应激和功能障碍密切相关。此外,线粒体靶向抗氧化肽SS-31可能为治疗肾脏纤维化和慢性肾衰竭(CRF)提供了新的思路和方法。
【图文】：

图１．注射ＨＯＣ１－ＲＳＡ及ＳＳ－３１对于各组大鼠血肌酐（Ａ），尿素氮（Ｂ），肌酐清除率（Ｃ）２４小时尿蛋白（Ｄ）的影响。变量使用均数士标准差表示（ｎ＝８）邋．＊表示与假手术组相比，逡逑／Ｋ０．０５；邋＃表示与邋５／６ＮＸ＋ｖｅｈｉｃｌｅ邋相比，ｐ＜０．０５；邋△表示与邋５／６ＮＸ＋ＨＯＣ１－ＲＳＡ邋相比，ｐ＜０．０５Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＨＯＣ１－ＲＳＡ邋ａｎｄ邋ＳＳ－３１邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｎ邋Ｓｃｒ邋（Ａ），邋ＢＵＮ邋（Ｂ），邋Ｃｃｒ邋（Ｃ）邋ａｎｄ邋Ｕｐ逡逑（Ｄ）邋ｉｎ邋５／６邋ＮＸ邋ｒａｔｓ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｍｅａｎｓ±ＳＤ（ｎ＝８）．邋ＡＮＯＶＡ，邋Ｐ＜０．０１邋ｉｎＡ，邋Ｂ，邋Ｃ邋ａｎｄ邋Ｄ．邋＊逡逑ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋ｓｈａｍ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ邋ｒａｔｓ；邋＃邋ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋５／６ＮＸ＋ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ；Ａ邋ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋５／６ＮＸ＋逡逑ＨＯＣ１－ＲＳＡ邋ｇｒｏｕｐ．邋ＮＸ，邋ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ；邋Ｓｃｒ，邋ｓｅｒｕｍ邋ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ；邋ＢＵＮ，邋ｂｌｏｏｄ邋ｕｒｅａ邋ｎｉｔｒｏｇｅｎ；邋Ｃｃｒ，逡逑ｃｌｅａｒａｎｃｅ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ；邋Ｕｐ，邋ｕｒｉｎａｒｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎ．逡逑二、注射ＨＯＣｌ－ＲＳＡ对５／６肾切除大鼠肾组织损伤的影响逡逑１．注射ＨＯＣ１－ＲＳＡ可加重５／６肾切除大鼠肾小球硬化程度逡逑与假手术组大鼠相比，其余各组５／６肾切除大鼠肾小球均出现不同程度的化损伤，具体表现为：系膜细胞增生，，系膜基质增多，局灶性节段性肾小球硬逡逑３０逡逑

逡逑图２－Ａ．肾脏组织ＰＡＳ染色（４００倍）及肾小球硬化指数。变量使用均数土标准差表示（ｎ＝８）．＊逡逑表示与假手术组相比，ｐ＜0．0５；邋＃表示与５／６ＮＸ＋ｖｅｈｉｃｌｅ相比，／Ｋ０．０５；邋Ａ表示与逡逑５／６ＮＸ＋ＨＯＣ１－ＲＳＡ邋相比，／Ｋ０．０５。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－Ａ．邋ｋｉｄｎｅｙ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｗｅｒｅ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｐｅｒｉｏｄｉｃ邋ａｃｉｄ邋Ｓｃｈｉｆｆ邋（ＰＡＳ，邋ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：逡逑４００）；邋ｒｅｎａｌ邋ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｓｃｏｒｅ邋ｗｅｒｅ邋ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｍｅａｎｓ±ＳＤ．邋＊Ｐ＜０．０５邋ｖｓ逡逑ｓｈａｍ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ邋ｒａｔｓ；邋＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋５／６ＮＸ＋ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ；ＡＰ＜０．０５邋ｖｓ邋５／６ＮＸ＋ＨＯＣ１－ＲＳＡ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑Ｂ逡逑Ｓｈａｍ逦５／６邋ＮＸ＋ｖｅｈｉｃｌｅ逦５／６邋ＮＸ＋ＨＯＣＩ－ＲＳＡ逡逑■Ｍｉｌ逡逑５／６邋ＮＸ＋＋ＳＳ－３１逦５／６邋ＮＸ＋ＨＯＣＩ－ＲＳＡ＋ＳＳ－３１逡逑图２－Ｂ．肾脏组织ＭＡＳＳＯＮ染色（２００倍）及肾间质纤维化评分。变量使用均数土标准差表逡逑示（ｎ＝８）邋．＊表示与假手术组相比，ｐ＜０．０５；邋＃表示与５／６ＮＸ＋ｖｅｈｉｃｌｅ相比，ｐ＜０．０５；邋Ａ表示与逡逑５／６ＮＸ＋ＨＯＣ１－ＲＳＡ邋相比
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

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本文编号：2573106