番茄红素对前列腺癌GSTP1基因调控机制研究

发布时间：2020-02-13 23:49

【摘要】：背景：前列腺癌是欧美国家男性肿瘤患者死亡的主要原因，近年来，我国前列腺癌的发病率呈上升趋势。前列腺癌发生主要与遗传基因和环境因素有关。谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）作为Ⅱ相解毒酶，可清除体内有害物质、保护DNA及一些蛋白质免受损伤。谷胱甘肽S-转移酶P1（Glutathione S-transferase pi-1，GSTP1)是GSTs中与肿瘤相关性最密切的成员，GSTP1的异常可能是前列腺癌发生发展的重要因素之一。人体自身不能合成、而只能从食物中摄取的番茄红素属异戊二烯类化合物，是抗氧化性最强的类胡萝卜素。大量流行病学和初期临床试验都证实了服用番茄红素对前列腺健康有很好的保护作用，不仅能降低患病危险性，还能减缓前列腺癌转移的进程。番茄红素在前列腺癌的预防和治疗中有着显著作用，番茄红素是否通过调节前列腺癌发生中关键的基因异常，如GSTP1的表达和活性而对前列腺发挥保护作用？这种保护又基于何种分子机制，目前皆不清楚。本研究分别采用采用不同来源的前列腺癌细胞株作为模型，，探讨番茄红素对前列腺癌GSTP1基因表达的调控研究，从一个新的分子靶点探寻番茄红素的抑癌机理，为临床上前列腺癌的防治研究提供可借鉴的基础研究数据和新的思路。第一部分番茄红素对前列腺癌GSTP1基因表观调控机制研究目的：利用两株前列腺癌细胞（雄激素依赖LNCaP细胞系、雄激素非依赖PC-3细胞系）作为前列腺癌细胞模型，采用不同浓度番茄红素处理，从而多角度检测番茄红素对前列腺癌细胞的凋亡、增殖，以及相关基因如II相代谢酶GSTP1基因表观遗传学调控影响。方法： MTS法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡和周期；甲基化PCR测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）分析GSTP1启动子和基因组ALU和LINE-1序列甲基化水平的影响；通过qPCR、Westernblot和免疫荧光分析基因mRNA或蛋白的表达。结果：1、5~20μmol/L番茄红素处理72小时可以分别诱导LNCaP和PC-3细胞凋亡，并通过G1期阻滞抑制细胞增殖。2、10μmol/L番茄红素处理LNCaP细胞14天降低ALU和LINE-1重复序列甲基化水平，未显著降低GSTP1启动子区CpG岛甲基化水平，GSTP1基因mRNA和蛋白表达无显著变化。3、10μmol/L番茄红素处理PC-3细胞14天显著降低GSTP1启动子区CpG岛甲基化水平，并上调GSTP1基因mRNA水平和蛋白水平表达。番茄红素的去甲基化作用可能是通过抑制甲基化转移酶DNMT3A的表达而引起。番茄红素对PC-3细胞ALU和LINE-1甲基化水平无显著影响。结论：番茄红素诱导两株前列腺癌细胞凋亡和G1期阻滞从而抑制细胞增殖。番茄红素处理对雄激素非依赖性PC-3细胞GSTP1启动子区CpG岛去甲基化从而上调GSTP1的表达，对雄激素非依赖性LNCaP细胞则无去甲基化作用。第二部分番茄红素通过Nrf2/ARE通路诱导GSTP1基因表达的研究目的：利用前列腺癌DU145细胞作为模型，采用不同浓度番茄红素处理，从体外细胞实验探索番茄红素是否通过Nrf2/ARE通路对GSTP1基因的表达发挥调控作用。方法：双荧光素酶报告基因检测番茄红素对GSTP1启动子区顺式调控元件ARE（pARE-luc报告基因质粒）的激活能力；利用siRNA-Nrf2抑制DU145细胞转录因子Nrf2表达后，检测番茄红素对pARE-luc报告基因质粒的激活能力。通过qPCR和Western blot实验观察番茄红素处理对DU145细胞GSTP1基因的mRNA和蛋白表达水平影响，以及当Nrf2基因过表达和抑制表达时GSTP1表达变化。结果：1、10μmol/L和20μmol/L番茄红素处理DU145细胞72小时显著提高pARE-luc报告基因启动子活性，同时上调GSTP1基因的mRNA和蛋白表达。2、当DU145细胞本底Nrf2的表达被siRNA-Nrf2抑制后，番茄红素失去了对pARE-luc报告基因的激活能力，同时也抑制了番茄红素诱导GSTP1基因mRNA和蛋白表达水平升高的能力。3、Nrf2过表达导致DU145细胞中的下游基因GSTP1表达增高。结论：番茄红素在DU145细胞中可以通过Nrf2/ARE通路诱导GSTP1基因的表达，从而发挥对前列腺健康的保护作用。
【图文】：

番茄红素,细胞生存,生存力

2.1 番茄红素对前列腺癌细胞增殖能力影响2.1.1 番茄红素对前列腺癌细胞生存力影响（MTS 法）番茄红素对前列腺癌细胞生存力的影响，研究分别采用 0, 5, 10, 20, 40μmol/L番茄红素和 5μmol/L AZA 处理 LNCaP（图 1.1.A）和 PC-3（图 1.1.B）细胞 24, 48,72 小时。与 0μmol/L 对照组相比，20、40μmol/L 番茄红素处理 72 小时，结果显示细胞存活率显著下降(P<0.05) 。然而，10μmol/L 番茄红素连续 72 小时处理两株前列腺癌细胞株都没有引起明显的细胞增殖抑制。因此，根据本实验 MTS 结果及番茄红素能在人体内达到的生理浓度结合考虑[7]，采用 10μmol/L 作为随后研究中番茄红素使用浓度。虽然本实验再一次证实了前人报道的高浓度番茄红素具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，但与以往报道相比，本研究番茄红素的抑制细胞增殖作用较弱[8,9]。

番茄红素,细胞凋亡,浓度依赖性

细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。本实验提示番茄红素能够诱导前列腺癌细胞凋亡，且具有一定的浓度依赖性（图1.2.I）。LNCap-LY(0μmol)/LLNCap-LY(10μmol)/L LNCaP-LY(20μmol)/LLNCaP-LY(5μmol)/L
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

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