缓激肽受体激活肾小管上皮细胞NF-κB信号通路介导三氯乙烯免疫性肾损伤机制研究

发布时间：2020-03-24 05:49

【摘要】：研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)作为常见的有机溶剂广泛应用于工业环境,接触TCE的工人出现以严重的全身性皮肤损害为主并伴有肝肾等多器官功能障碍,被命名为“职业性TCE药疹样皮炎”(Occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT)。早期研究认为ODMLT是由抗原特异性T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应,但近来研究发现,迟发型超敏反应不能完全解释由TCE导致的多脏器损伤。肾功能障碍是ODMLT病人多器官功能衰竭致死的主要原因之一。动物实验和ODMLT患者研究发现,免疫系统的功能失调在TCE致敏引起的肾损伤中发挥着重要作用。课题组研究中发现,TCE暴露导致激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system,KKS)激活,主要包括缓激肽(Bradykinin,BK)和激肽受体(B1R/B2R)水平的上调。然而,BK及其受体如何诱导免疫性肾损伤的病理机制尚不清楚。相关研究证明,B1R和B2R的表达活化参与了成骨细胞、成纤维细胞和结肠上皮细胞中NF-κB信号通路的激活。NF-κB信号通路在炎症和免疫反应中起着至关重要的作用,BK受体也可能通过激活NF-κB信号通路进一步加重TCE诱导的肾脏免疫性损伤。因此,本研究通过阻断BK与受体(B1R/B2R)结合来探索TCE致敏小鼠B1R/B2R受体与免疫肾损伤之间的相关性,从而为选择靶向药物进行有效的临床治疗提供新思路。研究目的本研究拟从整体动物实验到体外细胞实验两个层次来探索TCE介导免疫性肾损伤的作用机制。首先,通过整体动物模型观察BALB/c小鼠经TCE致敏后肾脏组织损伤B1R/B2R受体表达和NF-κB信号通路激活以及炎性因子水平表达情况,观察通过B1R/B2R受体拮抗剂干预处理后其对TCE致敏小鼠肾损伤的改变情况;再者,通过体外实验提取BALB/c小鼠肾小管上皮细胞进一步验证TCE介导免疫性肾损伤的作用机制。研究方法1.体内实验在适宜温度(20~25℃)和湿度(50±5%)的条件下饲养健康的无特定病原体级(specific pathogen-free,SPF)的雌性BALB/c小鼠(6~8周龄,18~24g),12小时光照/黑暗循环。所有小鼠自由进食饮水,适应性喂养1周(5只/笼)后,将小鼠随机分配到空白对照组,溶剂对照组,TCE处理组,TCE+B1R拮抗剂处理组或TCE+B2R拮抗剂处理组。构建TCE致敏的BALB/c小鼠模型,所有动物均在末次激发后24小时对皮肤过敏反应进行评分。在B1R/B2R拮抗剂处理组中,TCE激发前BALB/c小鼠在第17天和第19天腹膜内注射R715/HOE140进行干预。2.体外实验我们成功建立有效提取肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RETC)的方法来评价TCE致敏小鼠RETC的损伤。通过经腹主动脉穿刺用1mg/mlⅡ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶再灌注消化小鼠肾脏后,可获得较纯的肾小管节段,经过培养后肾小管上皮细胞爬出,采用免疫组织化学法和免疫荧光法标记角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)抗体鉴定该方法提取细胞主要为肾小管上皮细胞。结果1.致敏率和肾脏脏器系数在最终激发后24h进行评分,TCE组中的致敏率为44.3%(31/70),B1R拮抗剂预处理组的致敏率为40.5%(15/37),而B2R拮抗剂预处理组的致敏率为34.0%(18/53)。总致敏率为40.0%。空白对照组和溶剂对照组小鼠皮肤均未见红斑水肿的现象。小鼠的肾脏脏器系数比较发现:TCE处理24h后的小鼠肾脏脏器系数没有明显上升。72h TCE致敏组和B1R拮抗剂组的肾脏脏器系数要明显高于溶剂对照组,而72h B2R拮抗剂组小鼠肾脏脏器系数较TCE致敏组和B1R拮抗剂组明显降低。2.肾脏病理及肾功能改变肾脏组织病理检测发现空白对照组和溶剂对照组以及TCE未致组小鼠的肾脏组织中没有明显的病理改变,而72h TCE致敏组小鼠肾小管上皮细胞肿胀,近端小管上皮细胞刷状缘萎缩脱落甚至细胞坏死。比较发现,两个拮抗剂组小鼠的肾小管上皮细胞病理损伤显著减轻。肾功能检查结果发现,各指标在溶剂对照和空白对照组之间没有显著差异,72h阳性致敏组各指标较24h各组有显著升高。除血清BUN之外,Cr水平在两个拮抗剂预处理组中均有显著降低。血清微球蛋白?_1MG和?_2MG变化与Cr趋势一致,然而,B1RA没有显著降低血清?_1MG水平。3.肾脏组织中B1R和B2R表达情况免疫荧光通过CK18双标检测发现B1R和B2R主要在TCE致敏BALB/c小鼠肾脏的肾小管上皮细胞中表达。与空白对照组和溶剂对照组相比,72h TCE致敏组小鼠肾脏中肾小管上皮细胞中B1R和B2R表达显著增加,而TCE未致敏组的小鼠肾脏中的两个受体表达均没有明显增多。4.免疫组化法检测Kim-1,Lipocalin-2和NF-?B p65的沉积免疫组织化学分析法检测肾小管上皮细胞中标志性蛋白Kim-1和Lipocalin-2表达情况评估肾小管损伤。空白对照组和溶剂对照组小鼠的肾脏中没有明显可见的Kim-1和Lipocalin-2沉积,而72hTCE致敏组小鼠的这两种肾小管损伤标志性蛋白的表达显著增高,且两个拮抗剂组的表达均显著低于TCE致敏组。NF-?B p65在肾脏组织表达的结果表明,肾小管上皮细胞的NF-?B p65细胞核转位在72hTCE致敏组中表现最为显著,且两个拮抗剂组的表达均显著下降。各未致敏组中表达也没有显著差异。5.TCE诱导小鼠肾脏的NF-?B p65信号通路活化与溶剂对照组小鼠相比,TCE致敏组小鼠肾脏胞浆蛋白中p-I?B水平显增加且I?B显著降低,此外,肾脏组织的细胞核蛋白中,NF-?B p65亚基的水平显著升高。B1RA和B2RA预处理减弱TCE诱导的I?B磷酸化导致I?B水平的降低以及NF-?B p65亚基的核转位。并且,NF-?Bp65亚基的核转位在两个拮抗剂组之间差异有统计学意义。6.肾脏NF-?B p65及炎症因子mRNA水平空白对照组和溶剂对照组之间NF-?Bp65 mRNA表达的差异无统计学意义。与溶剂对照组相比,72h TCE致敏组及B1RA和B2RA致敏组的NF-?B p65mRNA表达水平明显升高。B1RA和B2RA致敏组与TCE致敏组相比,均显著抑制了NF-?B p65mRNA表达水平的增高。此外,两个拮抗剂致敏组之间相比较,NF-?B p65 mRNA表达水平无统计学差异。B1RA/B2RA干预有效地下调il-1β,tnf-α和il-17 mRNA的表达水平,且B1RA和B2RA两个拮抗剂组之间存在显著差异。此外,与24h时点B2RA预处理小鼠的il-1βmRNA水平,相比TCE致敏组有显著下降。7.成功建立酶液灌注法提取小鼠肾小管上皮细胞经腹主动脉用1mg/mlⅡ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶再灌注消化小鼠肾脏后获得较纯的肾小管节段并培养。并通过免疫组化法和免疫荧光法标记CK18抗体鉴定,证实该实验方法所提取细胞主要为肾小管上皮细胞。8.肾小管上皮细胞Megalin表达情况免疫荧光检测发现Megalin主要在小鼠肾脏的肾小管上皮细胞中表达。与空白对照组和溶剂对照组相比,72h TCE致敏组小鼠肾小管上皮细胞中Megalin表达显著减少,TCE未致敏组的细胞中的Melain表达没有显著减少。9.小鼠肾小管上皮细胞b1r和b2r mRNA表达TCE致敏小鼠的肾小管上皮细胞b1r和b2r mRNA的表达在空白对照组和溶剂对照组之间差异没有统计学意义,在72h TCE致敏组肾小管上皮细胞中显著上升,而TCE未致敏组则有明显的下降趋势。10.小鼠肾小管上皮细胞NF-?B信号通路活化TCE阳性处理组与溶剂对照组相比,肾小管上皮细胞p-I?B明显升高且I?B明显下降,同时,细胞核蛋白NF-?B p65明显升高。B1RA和B2RA显著抑制了p-I?B水平的增高和I?B水平的下降以及细胞核蛋白NF-?B p65的转位。两个拮抗剂处理组相比,只有p-I?B水平的差异有统计学意义。结论1.致敏剂量的TCE通过皮肤接触可致小鼠发生以皮肤损害为主并伴有肾脏病理和功能损伤的免疫毒性作用。2.TCE致敏的小鼠免疫性肾损伤中伴有KKS的活化,主要是B1R和B2R的表达增高,并通过活化NF-?B信号通路扩大炎症因子谱进一步加重TCE介导的免疫性肾损伤发病过程。3.通过成功建立提取肾小管上皮细胞的方法,再次检测细胞成分的基因水平和蛋白水平变化情况,验证TCE致敏的小鼠B1R和B2R活化NF-?B信号通路在免疫性肾损伤中发挥着重要作用。
【图文】：

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安徽医科大学博士学位论文胞因子表达，而这些细胞因子可介导肾小管上皮细胞损伤[36, 37]。核因clear factor-ΚB，NF-κB）是 Rel 转录因子的家族成员之一，由 RelA/p65,l, p50（NF-κB1）, and p52（NF-κB2）5 个成员组成，其中 P50 和 P65 两为重要，通常形成 P65-P50 异源二聚体以及 P50-P50 同源二聚体两种形

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缓激肽受体激活肾小管上皮细胞 NF-κB 通路介导三氯乙烯免疫性肾损伤假说示意图ctivation of Bradykin Receptor induces TCE-mediated immune renal tububy upregulation of NF-κB所述，我们推测 TCE 致免疫性肾损伤过程中，，KKS 活化产物 BB2R/B1R 结合激活肾小管上皮细胞的 NF-κB 信号转导通路，改变子水平介导肾小管上皮细胞损伤，并且可能通过再次扩大补体系免疫和体液免疫效应，进一步加重免疫性损伤过程。为此，本物实验并结合体外实验，首先观察 TCE 致敏小鼠 BK/DBK R 结合激活肾小管上皮细胞 NF-κB 通路炎性细胞因子水平改变情采取分离培养 TCE 致敏小鼠肾小管上皮细胞，观察使用 B2R肾小管上皮细胞 NF-κB 信号转导通路活化改变情况。最后，
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

【参考文献】