糖蛋白质组学新方法及其在IgA肾病中的应用研究

发布时间：2020-03-24 06:38

【摘要】：蛋白质糖基化修饰是最复杂的蛋白质翻译后修饰,在生命过程中发挥重要的功能。常见的蛋白质糖基化修饰包括:N-糖基化、O-GalNAc糖基化和O-GlcNAc糖基化等,其结构多样,分布广泛,并以多种方式参与基因转录、蛋白翻译、信号传导、细胞-细胞间以及宿主-病原体相互作用等基本生物学过程。其异常变化与免疫性疾病、肿瘤、先天性糖缺陷等重要疾病的发生发展相关。因此,糖基化作为蛋白质翻译后修饰研究中的热点和难点,一直受到广泛关注。本文研究重点为糖蛋白质组学新方法及其在IgA肾病中的应用研究,包括正常人、非新月体和新月体IgA肾病患者血浆IgA1的N-糖链与O-糖基化肽段定性定量比较分析,正常人和IgA肾病患者血浆定量O-糖蛋白质组学分析,以及基于氮化碳基底的糖肽高效富集新材料的开发和应用。本论文由四部分组成。第一章:我们概述了蛋白质糖基化修饰的基本概念、研究方法和生物学功能,综述了IgA肾病中的IgA1糖基化的研究现状、糖基化修饰方法学难点以及基于质谱的糖蛋白质组研究现状,包括血浆O-糖蛋白质组的研究现状、糖蛋白或糖肽富集技术的研究现状。第二章:IgA肾病(IgAN)是世界范围内常见的原发性肾小球疾病,以肾小球系膜区IgA1沉积和持续发炎为典型免疫病理特征,新月体IgA肾病是其中最严重的一型。以前的研究表明IgAN患者血浆中的IgA1的糖修饰会发生异常,但是没有区分单体和多聚体IgA1的糖基化,也没有对糖链和糖肽丰度变化进行系统性研究。为此,我们建立了简单快速且重复性好的单体IgA1(mIgA1)和多聚体IgA1(p IgA1)样品制备方法和生物质谱糖修饰系统性分析方法,并对12例正常人、11例非新月体IgAN患者以及11例新月体IgAN患者血浆中的mIgA1和p IgA1的N-糖链以及完整O-糖基化肽段进行了定性定量比较分析,发现mIgA1和pIgA1的糖基化修饰(如高甘露糖型)存在差异,在健康人、非新月体和新月体IgAN患者血浆mIgA1中发现了4条N-糖链和13条完整O-糖基化肽段表达具有显著差异(P0.01),在健康人、非新月体和新月体IgAN患者血浆pIgA1中发现4条N-糖链和17条完整O-糖基化肽段表达具有显著差异(P0.01)。这些差异显著的糖链和糖肽可能作为潜在的疾病诊断标志物或者治疗靶标,并为IgA肾病的分型和发病机制解释提供依据。第三章:O-糖基化蛋白质组的表达变化与人类疾病如癌症、炎症和退行性疾病等相关。为了发现IgAN患者血浆中异常表达的O-糖蛋白/肽段,并作为潜在生物标记物用于IgA肾病的分型和诊断,我们进行了位点特异性O-糖蛋白质组学研究。但是由于O-糖基化修饰的微观不均一性和宏观不均一性,人血浆中的位点特异性O-糖基化分析仍然具有挑战性。为此,我们发展了一个系统性分析策略,该策略结合多酶酶切、多维分离的样品制备、高分辨率串联质谱鉴定以及Byonic软件分析,可以实现对完整的O-糖肽进行表征。结果表明,多酶酶切或多维分离可以使样品制备更加有效,EThcD碎裂模式不仅适用于单位点修饰的O-糖基化肽段(50.3%)的鉴定,而且还适用于二重(21.2%)和三重(28.5%)位点修饰的O-糖基化肽段的鉴定。使用严格的打分标准,在人血浆中鉴定出源于49个O-糖蛋白的499条非冗余完整O-糖肽,173个O-糖基化位点和6种O-糖链,其中包括121个新的O-糖基化位点。这是目前人血浆样品的位点特异性O-糖蛋白组的最大数据集。这项研究开发的策略有助于深入分析人血浆中的O-糖蛋白,为了解蛋白质O-糖基化在人类健康和疾病(IgA肾病)中的功能奠定基础。此外,还建立了基于双甲基标记的定量O-糖蛋白度质组学方法,并应用于IgA肾病血浆O-糖蛋白组研究,发现了差异的O-糖基化蛋白和肽段,可能与疾病的发生发展有关,是潜在的生物标志物。第四章:糖肽在蛋白质中化学计量很低,从复杂生物样品中直接检测糖肽十分困难,因而,糖肽富集是深度覆盖糖蛋白组的关键步骤。商业化糖肽富集材料HILIC特异性和富集效率并不足够高,因而需要开发一种高特异性和高富集效率的糖肽富集材料。在本章中,我们制备了一种新的自组装亲水苯硼酸功能化的薄层C_3N_4材料(MPBA-Au@s-C_3N_4,MASC),该材料可基于B-N之间的协同效应来增强对糖肽的亲和力,进而实现对糖肽的有效富集。采用XPS光谱、Zeta电位测试和茜素红S(ARS)显色反应对该材料进行了表征,证明了B-N键的存在。采用标准蛋白IgG以及辣根过氧化物酶(HRP)对该材料的性能进行了评价,表明该材料对糖肽的富集具有优越的性能,包括低pH适应、亲水性、稳定性、重复性和可循环利用性、高选择性(1:100)、低检测限(0.33 fmol/μL)、高富集效率(~80%)和高回收率(~90%)。该材料也被成功地分别应用于从标准蛋白和复杂样品中无偏性地捕获糖肽,鉴定了来自IgG的37条糖肽和HRP的21条糖肽。该材料用于人尿糖肽的富集,分别从女性和男性尿液样品中鉴定出来自839个糖蛋白的1465条糖肽和来自884个糖蛋白的1553条糖肽。还从5μL的人血浆中鉴定到209种糖蛋白的463条糖肽。证明新型材料MASC可有效富集人血液和尿液中的糖肽,有可能应用于IgA肾病等疾病糖肽标志物的筛选研究,在蛋白质糖基化研究领域有良好的应用价值。
【图文】：

蛋白质糖基化,N-糖基化,哺乳动物细胞,途径

军事科学院博士学位论文14]。在肿瘤细胞中，O-GalNAc 糖基化会异常改变，产生截短型 O-糖，Tn 抗原），开发靶向这些 O-糖链的疫苗，为癌症治疗提供了新的思路cNAc 糖基化与多种翻译后修饰如磷酸化之间存在相互作用[16, 17]，共的活性与功能，作为压力感受器和营养感受器发挥重要作用[18, 19]。和癌组织中发现 OGT 上调，OGA 下调，，导致 O-GlcNAc 糖基化修饰水升[20, 21]。

人体,结构示意图,铰链区,重链

包括含量最多的单体 IgA1（mIgA1），少量的多聚体（pIgA1）。IgA1 的结构如图1.2 所示[34]，其含有两条重链和轻链，在重链 Cα1 和 Cα2 之间存在一个由 19 个氨基酸组成的铰链区（HR），该铰链区富含 Ser、Thr 和 Pro，存在 9 个潜在的O-糖基化位点，通常 3~6 个位点同时被单/双唾液酸核心 1 结构或 Tn 抗原所修饰[35]。在重链 Cα2 和 Cα3 上各自存在一个 N-糖基化位点，分别是 Asn263 和Asn459[36]。在人类免疫球蛋白中，绝大多数都会发生 N-糖基化，但是目前只发现 IgA1、IgG3 和 IgD 的铰链区会发生 O-糖基化[37, 38]。在 IgAN 小鼠模型（β4Gal9-Ⅰ缺陷小鼠）中
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692.31

【相似文献】