膀胱缺血相关蛋白修饰的特征揭示应激途径在缺血性膀胱中的重要性

发布时间：2020-03-29 23:37

【摘要】：下尿路症状(LUTS)是一种常见的泌尿系统疾病,其患病率随着年龄的增长而增加。传统认为,男性LUTS通常被认为是良性前列腺增大而引起的膀胱出口梗阻,后来发现在许多病例中,男性的LUTS与膀胱出口梗阻无关。越来越多的证据表明慢性膀胱缺血在男性和女性的非梗阻性膀胱功能障碍和下尿路症状的发生发展中起着重要作用。然而,慢性缺血引发的LUTS和膀胱功能障碍的分子机制尚未完全清楚。蛋白质是生命活动的执行者和体现者,蛋白组学技术能直接从蛋白的整体水平反应蛋白质的动态变化。通常情况下,蛋白质是根据基因组编码序列直接翻译确定的。然而,由于翻译后修饰,氨基酸替换以及RNA编辑等原因,许多氨基酸残基往往会发生改变,它们的相对分子质量不同于基因组中的编码氨基酸,从而改变了蛋白质的结构与功能,这类氨基酸我们称之为非编码氨基酸(ncAAs)。近年来,许多缺血再灌注损伤相关疾病与蛋白质翻译后修饰密切相关,探究膀胱缺血的分子机制有望从蛋白质翻译后修饰水平上开辟新的道路。本文运用了基于质谱的蛋白质组学相关技术,研究大鼠慢性膀胱缺血中非编码氨基酸的差异,进一步阐明了慢性膀胱缺血可能的发病机制,为人类下尿路症状的早期诊断和药物靶向治疗提供了理论依据。研究目的:探讨慢性膀胱缺血对膀胱蛋白质组中非编码氨基酸的变化以及缺血相关修饰蛋白信号通路的特征。研究方法:本研究随机选取三对雄性大鼠进行双侧髂动脉阻塞模拟动脉粥样硬化和慢性膀胱缺血,8周后称取膀胱组织并进行胶内酶解,利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)反复测定获得高质量的质谱数据。通过Byonic软件进行相关的匹配计算得到所有非编码氨基酸信息,利用PANTHER、STRING和DAVID数据库进行生物信息学的分析。最后通过缺血性疾病患者的血液样本进行质谱分析,验证缺血相关蛋白修饰的差异,为找到人类下尿路症状临床诊断和治疗的分子标志物提供理论基础。实验结果:1.大鼠慢性膀胱缺血对不同类型蛋白质修饰的影响根据定义,实际蛋白质氨基酸残基的质量与标准编码氨基酸的质量不同的氨基酸残基为非编码氨基酸,这些非编码氨基酸可能是由基因组点突变、RNA编辑、翻译后修饰甚至还可能存在其他机制。在大鼠慢性膀胱缺血组织中,这些氨基酸上的非零质量差改变大部分稳定地发生在缺血和对照组织中,表明在大鼠膀胱蛋白质组中存在系统发生的非编码氨基酸。这些大量非编码氨基酸(13039)存在于1549个不同的蛋白质位点并分为52种修饰聚类簇。其中,70个蛋白质的171个修饰位点上调或下调2倍以上(p0.05),这些蛋白称之为缺血相关蛋白。在缺血组织中,有17个修饰聚类簇发生显著性失调(R20.2,ratio2倍,p0.05),被认为是潜在的缺血相关蛋白修饰。在这些修饰中,根据它们质量差大小通过相关数据库分析得出其中9个与氨基酸的替换有关。提示这些ncAA的改变可能与缺血密切相关。2.缺血相关蛋白的生物信息学分析通过对缺血相关修饰蛋白的PANTHER功能注释,这些差异修饰所涉及的蛋白质主要有细胞骨架蛋白、结合蛋白和具有催化功能酶类。STRING预测了上调或下调相关修饰蛋白的相互作用网络图。DAVID分析相关蛋白参与的信号通路表明,这些缺血相关蛋白主要参与了血浆血红素的清除,平滑肌收缩,HSF1依赖的反式激活,血小板胞浆Ca2+升高对血小板脱颗粒反应,四氢生物蝶呤的合成、回收和调节等通路。其中一些通路中的蛋白非编码氨基酸的改变可能在缺血过程中具有重要的作用。3.缺血过程中上调和下调最多的非编码氨基酸经统计分析,在慢性膀胱缺血中共有148个蛋白质修饰位点发生下调,其中下调倍数变化最多的为分子量增加14.017 Da的修饰。Val+14.017修饰在慢性膀胱缺血中下调9倍,且主要发生在血清白蛋白的431位点。对于膀胱缺血上调修饰中,上调倍数最明显的蛋白质修饰是在血红蛋白21位点,分子量增加为26.022 Da,根据它们改变的质量差推断发生了AlaPro替换。4.慢性膀胱缺血中发生修饰种类最多的蛋白质在慢性膀胱缺血过程中发现了大量的非编码氨基酸,它们分布于366个不同的蛋白质中,血清白蛋白是发生频率最多的差异修饰蛋白。在白蛋白中发现了30种不同的ncAAs,存在于12种不同类型的非零质量差且发生在26个蛋白质位点上,其中发生的许多修饰都与白蛋白的氧化有关。5.人类缺血性疾病中缺血相关修饰蛋白验证为了验证大鼠慢性膀胱缺血中白蛋白相关的氧化修饰是否同样存在于其他缺血模型中。本文各选取了三名急性心肌梗死患者与健康人的血液进行了质谱分析。通过对固定修饰进行搜索,比较了在血清中白蛋白谷胱甘肽化修饰变化。我们的数据表明,在人急性心肌梗死疾病中同样发生了在白蛋白591位点谷胱甘肽修饰的上调(ratio2,p0.05),表明了该位点的谷胱甘肽修饰变化与缺血再灌注损伤有关。结论:本研究中首次发现了大量未报道的大鼠慢性膀胱缺血非编码氨基酸,膀胱蛋白修饰谱在缺血时的改变可能会提供新的线索来了解潜在的分子通路。因此,本文对于了解人下尿路症状发病机制以及靶向药物的治疗具有重要的意义。
【图文】：

控制组,质量差,密码子

１．２在膀胱缺血组织中氨基酸替换的失调逡逑在这１７个缺血相关修饰中，根据它们质量差大小通过相关数据库查找得出逡逑其中９个与氨基酸的替换相关。缺血时下调最多的质量差为１４．０１７２邋（Ｒａｔｉｏ＝－１７．５，逡逑ｐ＜０．０１，ｃｏｕｎｔ＝４１８），与Ｄ＞Ｅ，Ｎ＞Ｑ，Ｓ＞Ｔ或Ｖ＞Ｉ／Ｌ氨基酸替换匹配，质量误差小逡逑于０．００２邋Ｄａ。这一质量差主要出现在血清白蛋白４３１位点缬氨酸上，通过对基因逡逑组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ数据库的比较，发现其在缺血组织中是由密码子ＧＴＴ到密码逡逑子ＡＴＴ的位点突变，表明了邋Ｖ＞Ｉ／Ｌ位点的替换与缺血有关。逡逑缺血时最丰富且上调最高的质量差为－１５．９７５９邋（Ｒａｔｉｏ＝３．０，邋ｐ＜０．０１，邋ｃｏｕｎｔ＝８５），逡逑与Ｃ＞Ｓ氨基酸替换质量差相匹配。这种质量差仅存在于血红蛋白中，在该位点逡逑上，从密码子ＴＧＴ到密码子ＴＣＴ的点突变可能会产生Ｃ＞Ｓ氨基酸替换。虽然逡逑在这个位置没有发生变异或自然发生的变异，但这表明了一个新的机制，在缺血逡逑相关的点突变发生在ＴＧＴ＞ＴＣＴ，导致血红蛋白Ｃ＞Ｓ替换发生上调。逡逑

蛋白,细胞骨架蛋白,相关蛋白,聚类

结合蛋白类，参与多种信号通路具有催化活性的酶类。其中转凝蛋白（Ｔａｇｌｎ）、逡逑血清白蛋白（Ａｌｂ）、甘油醛－３－磷酸脱氢酶（Ｇａｐｄｈ）分别位于三类蛋白网络的逡逑中心节点，提示这些分子相关修饰在缺血过程中可能发挥着重要作用（图３ａ）。逡逑在３７个修饰下调的蛋白质中（仅显示了邋２６个连接的蛋白质），由这些蛋白质形成逡逑的相互作用网络主要分为三个蛋白聚类簇：第一类为细胞骨架和转运蛋白，代表逡逑分子有丝切蛋白（Ｃｆｌｌ）、肌间线蛋白（Ｄｅｓ）、肌球蛋白轻链９邋（Ｍｙｌ９）、载逡逑脂蛋白（Ａｐｏａｌ）。第二类为代谢相关的酶，，代表分子有ＡＴＰ合酶（ＡＴＰ５ａｌ、逡逑ＡＴＰ５ｂ）、泛素羧基末端水解酶ＬＩ邋（Ｕｃｈｌｌ）、磷酸激酶Ｂ邋（Ｃｋｂ）。第三类为逡逑核酸结合蛋白，代表分子主要为热休克蛋白家族（Ｈｓｐａｌ、Ｈｓｐｂ６、Ｈｓｐａ８、逡逑Ｈｓｐ９０ａａｌ、Ｃｒｙａｂ）等（图邋３ｂ）。逡逑ａ．逡逑Ｐｔｒｆ逡逑＿逦Ｃ３逡逑逦邋ｆｒｏｍ邋ｃｕｒａｔｅｄ邋ｄａｔａｂａｓｅｓ逡逑逦ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ逡逑逦邋ｇｅｎｅ邋ｎ？ｇｈｂｏｒｈｏｏｄ逡逑ａ—＾Ｃａｌｄｌ逦逦邋ｇｅｎｅ邋ｆｕｓｉｏｎｓ逡逑ｆ邋＼逦—邋ｇｅｎｅ邋ｃｃＫｉｃｃｕｒＴｅｎｃｅ逡逑ＩＰＭ逦逦邋ｌｅｘｌｍｉｎｉｎｇ逡逑逦邋ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｈｏｍｏｌｏｇｙ逡逑３２逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R694

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