Nec-1对高糖作用下大鼠肾小球内皮细胞坏死性凋亡途径的影响

发布时间：2020-04-02 00:31

【摘要】：目的:通过细胞实验,研究Necrostatin-1(Nec-1)是否能够减轻高糖作用下大鼠肾小球内皮细胞(Rat glomerular endothelial cells,RGECs)坏死性凋亡的发生,进而减轻细胞死亡、炎症反应,并探讨其机制。方法:对RGECs进行体外培养,用凝血因子VIII鉴定为内皮细胞后,将其根据不同干预条件随机分为以下四组:正常组(5.5mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)、高糖组(30mmol/L葡萄糖)、高糖+Nec-1组(30mmol/L葡萄糖+100μmol/L Nec-1)。采用免疫细胞化学、免疫荧光检测各组RIP1、RIP3和IL-6的蛋白表达定量及定位;采用Real-time PCR检测各组RIP1、RIP1和IL-6的mRNA表达情况;采用蛋白印迹法(WB)检测各组RIP1、RIP3和IL-6的蛋白表达情况。结果:1.培养的大鼠肾小球细胞胞浆内可表达凝血因子VIII,鉴定为内皮细胞。2.免疫细胞化学:RIP1、RIP3、IL-6主要在RGECs胞浆中表达,高糖组的表达量明显高于正常组和甘露醇组(P值均0.01),而高糖+Nec-1组较高糖组明显减少(P0.01),其余组之间上述指标的表达无差异(P0.05)。3.免疫荧光:RIP1、RIP3、IL-6主要在RGECs胞浆中表达,且高糖组的荧光明显强于正常组和甘露醇组,而高糖+Nec-1组荧光亮度明显弱于高糖组,其余组之间无明显亮度差异。4.实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time polymerase chain reaction,RT-PCR):高糖环境下,RIP1、RIP3、IL-6的mRNA相对表达量明显高于正常组及甘露醇组(P值均0.01),而在高糖+Nec-1组的表达较高糖组明显减少(P0.01),其余组之间上述指标的表达无差异(P0.05)。5.蛋白印迹法(Western Blot,WB):高糖环境下,RIP1、RIP3、IL-6的蛋白表达量明显高于正常组和甘露醇组(P值均0.01),而高糖+Nec-1组的表达较高糖组明显减少(P0.01),其余组之间上述指标的表达无差异(P0.05)。结论:RGECs在高糖刺激下,发生坏死性凋亡明显增多,进而发生了较明显的炎症反应和损伤,而使用了坏死性凋亡特异性阻断剂Nec-1干预后,以上指标的表达均下调,说明Nec-1可能通过抑制坏死性凋亡途径,从而减轻RGECs的炎症反应。
【图文】：

2.1.1 细胞形态RGECs细胞成贴壁生长，密度较均匀，大致形态为梭形或椭圆形，胞浆饱满，可见其中圆形细胞核，有时可见双核。（见图1）图1 正常RGECs形态（×100）2.1.2 细胞鉴定荧光显微镜下可见DAPI将细胞核染成蓝色，Ⅷ因子为绿色，重合后可见主要表达于RGECs胞浆中，，故细胞鉴定为内皮细胞，可见细胞形态为梭形或多边形。（见图2）DAPI Factor Ⅷ Merge图2 Ⅷ因子荧光染色（×200）

2.1.2 细胞鉴定荧光显微镜下可见DAPI将细胞核染成蓝色，Ⅷ因子为绿色，重合后可见主要表达于RGECs胞浆中，故细胞鉴定为内皮细胞，可见细胞形态为梭形或多边形。（见图2）DAPI Factor Ⅷ Merge图2 Ⅷ因子荧光染色（×200）
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】

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本文编号：2611179