SOX17基因在膀胱癌发生进展中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-03 13:16

【摘要】：【背景】膀胱癌通过两种不同的途径发展,导致非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。这两种亚型具有独特的病理特征和不同的分子特征。大约60%NMIBC经尿道电切术治疗后会复发,且20-30%会进展为MIBC。而MIBC患者预后差,并且30年来总体生存率没有变化。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)由美国政府发起。这项关于肿瘤的基因特征研究不仅提供了可能作为治疗靶点的基因驱动因素的信息,而且还提供了侵袭性疾病亚型或集群的信息。这些群集可能与预后因素和独特的治疗有关,从而提高疾病诊断、治疗和预防癌症的能力,也为进一步研究分析膀胱癌发病机制、治疗靶点和侵袭性疾病亚型或集群信息提供条件。这些可能与预后因素和治疗方法有关,并可能最终向个体化患者管理迈出一步。为此,本研究依据TCGA数据库分析了膀胱癌差异表达基因并进行验证以及生物学功能研究。【目的】通过TCGA数据库转录组数据生物信息学分析筛选膀胱癌与正常尿路上皮差异表达基因,并进行验证,研究其生物学功能。【材料与方法】1.运用TCGA数据库下载RNASeqV2(n=433)矫正数据文件,筛选膀胱癌差异表达基因,进行差异基因集分析(gene set variation analysis,GSVA)、差异基因富集分析,筛选候选基因SOX17。2.配对的膀胱癌组织及正常尿路上皮组织(n=40)提取RNA并进行qRT-PCR,验证SOX17在膀胱肿瘤组织及正常尿路上皮中mRNA差异表达3.联合公共数据库数据库和临床样本膀胱癌石蜡切片(包括膀胱癌石蜡切片(n=150)和正常尿路上皮组织石蜡切片(n=50)),探索SOX17基因表达量与膀胱癌的病理分期和膀胱患者预后的关系。4.检测正常尿路上皮细胞系和膀胱癌细胞系SOX17基因mRNA和编码蛋白表达量。5.瞬转干扰RNA(siRNA)方法对SOX17基因高表达细胞系BIU-87行基因干扰,通过质粒转染对SOX17基因低表达细胞系UMUC-3进行基因过表达。通过CCK-8实验检测SOX17基因敲减对细胞系BIU-87细胞增殖能力影响,SOX17基因过表达对细胞系UMUC-3细胞增殖能力影响。6.细胞划痕实和Transwell迁移实验探索SOX17基因干扰对膀胱癌细胞迁移能力的影响;SOX17基因过表达分别对膀胱癌细胞迁移能力的影响。7.Transwell小室细胞侵袭实验探索SOX17基因干扰和过表达分别对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。【结果】1.RNASeqV2(n=433)矫正数据文件分析得到膀胱癌全转录组基因表达量与正常尿路上皮组织表达量差异倍数矩阵。筛选条件如下:(1)差异表达倍数log_2foldchange(log_2FC)"g2;(2)伪发现率(false discovery rate,FDR)0.01;SOX17基因表达量在正常尿路上皮中显著高于膀胱癌组织,其log_2FC=-2.879,FDR=1.52E-37;文献检索分析证实膀胱癌有关研究中无SOX17基因报道。2.提取配对的膀胱癌组织和正常尿路上皮组织(n=40)RNA进行qRT-PCR实验验证SOX17基因差异表达,其中33例患者膀胱癌组织SOX17表达量低于配对的正常尿路上皮组织。3.TCAG数据库数据分析发现SOX17在正常组织中表达量显著高于膀胱癌组织,膀胱癌组织中Stage III SOX17表达量高于Stage IIIIV。Oncomine数据库分析发现,SOX17在正常尿路上皮组织中表达量高于膀胱癌组织,在NMIBC中表达量高于MIBC。4.膀胱癌石蜡切片(n=100)和正常尿路上皮石蜡切片(n=50)SOX17基因免疫组化染色分析证实正常尿路上皮SOX17表达量高于NMIBC,NMIBC中SOX17基因表达量高于MIBC。膀胱癌患者中SOX17高表达患者总体生存率明显高于SOX17低表达患者。5.CCK-8细胞增殖实验表明,siRNA干扰SOX17基因表达膀胱癌细胞BIU-87增殖能力无显著变化。质粒转染过表达SOX17基因膀胱癌细胞UMUC-3增殖能力明显弱于阴性对照组。6.划痕实验证实,siRNA干扰SOX17基因表达膀胱癌细胞BIU-87迁移能力无显著变化,质粒过表达SOX17基因膀胱癌细胞UMUC-3迁移能力相较于阴性对照组明显减弱。Transwell实验证实siRNA干扰SOX17基因表达膀胱癌细胞BIU-87迁移能力无显著变化,质粒过表达SOX17基因膀胱癌细胞UMUC-3迁移能力相较于阴性对照组明显减弱。7.Transwell小室细胞侵袭实验证实siRNA干扰SOX17基因表达膀胱癌细胞BIU-87侵袭能力无显著变化,质粒过表达SOX17基因膀胱癌细胞UMUC-3侵袭能力相较于阴性对照组明显减弱。【结论】SOX17在正常尿路上皮组织中表达量高于膀胱癌组织,在NMIBC表达量高于MIBC,与膀胱癌病理分期相关。SOX17低表达与预后不良相关。SOX17与膀胱癌生物学功能相关,SOX17过表达显著抑制膀胱癌细胞系UMUC-3增殖、侵袭、迁移,而SOX17干扰对膀胱癌细胞系BIU-87增殖、迁移、侵袭无显著影响。
【图文】：

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军医大学硕士学位论文（二）结果1.差异表达的分子差异表达基因筛选标准为:1.|log2FC|"g2;2.FDR＜0.01。按照设定的筛选条筛选出 1833 个显著差异表达基因，其中 992 个基因在膀胱癌组织中较正皮组织中表达上调，与之相对应，841 个基因显著下调。图 1-1 为 411 例与 19 例正常尿路上皮差异表达基因火山图。图 1-2 为 411 例膀胱肿瘤与尿路上皮差异表达基因热图。

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图 1-2.411 例膀胱肿瘤与 19 例正常尿路上皮差异表达基因热图。筛选标准为 FDR＜0.01，|log2FC|"g2。红色表示相较于正常尿路上皮细胞在膀胱癌中上调的基因，黑色表示基因在正常尿路上皮中与膀胱癌中表达相似。绿色表示相较于正常尿路上皮细胞膀胱癌中下调的基因。2.基因本体分析基因本体（Gene Ontology,GO）作为功能分类体系，由生物过程(biologicalprocess,BP) ，分子功能（ molecular function,MF ）和细胞组分 (cellularcomponent,CC) BPCC 这三个部分组成。我们对 411 例膀胱肿瘤与 19 例正常尿路上皮组织行 GO 分析。如图 1-3 示，差异表达基因在 BP、MF、CC 上富集。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14

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