TRPC6介导的自噬调控机制及其在近端肾小管细胞氧化应激损伤中的作用研究

发布时间：2020-04-14 13:52

【摘要】：活性氧(reactive oxygen species,ROS)是在生物体内氧代谢过程中产生的高活性含氧物质的总称,包括过氧化物、超氧化阴离子和羟自由基等,既是正常代谢的副产物,也可以在病理条件下产生,如肾缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。正常情况下,ROS在细胞的信号转导和维持细胞内稳态中发挥重要作用,但是ROS的过度生成会引起氧化应激反应,对细胞产生损伤。例如在肾的I/R损伤中,ROS导致的氧化应激使肾近端小管细胞(proximal tubular cells,PTC)受损。自噬(Autophagy)在细胞损伤修复中扮演着重要角色,它是普遍存在于大部分真核细胞中的一种现象,可通过溶酶体介导降解细胞内长寿蛋白和受损的细胞器。自噬既是正常情况下维持细胞内稳态的重要保守机制,也是一种细胞在外界压力、饥饿、缺氧和内质网应激等特殊情况下的自我生存机制。自噬机制的受损与肿瘤、神经退行性疾病、代谢相关疾病、免疫性疾病等发病过程密切相关。大量证据表明,自噬与非选择性阳离子通道超家族TRP(transient receptor potential)有着密切联系。经典型瞬时受体电位通道6(transient receptor potential canonical6,TRPC6)是TRP中的一员,在肾脏疾病中发挥重要作用。然而,在肾的近端小管细胞中,TRPC6与自噬的关系以及它们在肾氧化应激损伤中的作用尚不清楚。本研究采用野生型(wild type,WT)小鼠和TRPC6基因敲除(TRPC6~(-/-))小鼠作为实验材料及研究对象,利用肾小管体外贴壁培养法培养原代近端小管细胞,利用分子生物学方法探讨了TRPC6在ROS导致的PTC自噬中的作用及其对细胞凋亡的影响。在本研究中,我们发现氧化应激触发PTC中TRPC6依赖的Ca~(2+)内流,进而抑制自噬,使细胞更容易死亡。我们还证实TRPC6基因敲除(TRPC6~(-/-))或利用SAR7334抑制TRPC6均可增强自噬流,减轻氧化应激导致的PTC凋亡。TRPC6敲除的保护性作用可以被自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,BAF)所阻止。此外,本研究还表明,阻断TRPC6可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR和ERK1/2信号通路促进自噬流。本研究首次证明TRPC6介导的Ca~(2+)内流在抑制PTC氧化应激诱导的细胞保护性自噬中具有重要作用,TRPC6可能成为未来防治肾氧化应激损伤的新靶点。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文研究结果1. TRPC6 参与 ROS 介导的钙内流1.1 ROS 促进肾近端小管细胞中 TRPC6 蛋白表达肾近端小管细胞主要表达 TRPC3 和 TRPC6 两种亚型，它们在多种病理过程中发挥协同作用，，为了观察 ROS 对这两种亚型的影响，我们用不同浓度的 H2O2（图 1A）或叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide, t-BOOH）（图 1B）刺激原代培养的肾近端小管细胞（proximaltublarcell,PTC）12h，用免疫印迹试验（Westernblot 法）检测 TRPC3 和TRPC6 在 PTC 中的表达。检测结果发现，与对照组相比，氧化应激增强了肾近端小管细胞中 TRPC6 的表达，对 TRPC3 表达的影响不明显。在后面的研究中，我们主要研究TRPC6。

图 2. TRPC6 参与 ROS 介导的 SOCEA 示 H2O2处理增加 PTC 中 Tg 诱导的 SOCE，增加钙离子内流。B 示原代 PTC 中，TRPC6 抑制剂SAR7334 可抑制 H2O2介导的 SOCE。C 示 TRPC6 基因敲除小鼠原代 PTC 中，TRPC6 表达较 WTPTC 显著降低，Bar=20μm。D 示 TRPC6-/-PTC 中，H2O2激活的 SOCE 被抑制。柱状图示 SAR7334及 TRPC6-/-导致的细胞内 SOCE 介导的胞内钙离子峰值的改变，显示对三次独立实验结果的统计学分析，以 P 0.05 为有统计学意义，用星号（*）表示。1.3 TRPC6 参与 ROS 介导的 ROCE为了验证 TRPC6 是否具有类似 ROC 样的作用，我们使用了 TRPC6 的激活剂 OAG（1-oleoyl-2-acetyl-glycerol ，OAG），并检测受体门控性钙内流 ROCE（receptoroperatedcalciumentry，ROCE）。正常情况下，HK-2 细胞中 TRPC6 表达水平极低，H2O2不能引起细胞钙离子内流，在 H2O2处理同时应用 TRPC6 激活剂 OAG 仅可引起微弱的钙离子
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

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本文编号：2627365