NLRP3炎性小体活化在急性与慢性肾损伤中作用及机制的研究

发布时间：2020-04-17 13:31

【摘要】：目的:炎症反应是急慢性肾损伤的共同特征,炎症反应持续存在会引起肾小管间质纤维化的形成。NOD样受体(Nod-like receptor,NLR)家族是固有免疫的重要成员,通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)激活下游炎症信号通路,进而引起炎症反应。NLRP3是NLR家族中研究最为广泛的成员,在PAMP或DMAP的刺激下活化,促进下游炎症因子IL-1β和IL-18的成熟和释放,加重组织炎症和损伤。但是NLRP3炎性小体在肾损伤后炎症反应发生中的作用及调节机制仍不十分清楚。本研究拟通过体内、体外实验,探讨NLRP3炎性小体在急、慢性肾损伤后肾组织炎症反应中的作用,并探讨其可能的调节机制。方法:1.在NLRP3炎性小体在缺血性急性肾损伤中的作用研究中,我们运用成年雄性野生型或NLRP3敲除小鼠构建肾脏缺血再灌注模型。分组后,分别夹闭肾蒂25分钟或仅做开关腹处理。3天后处死小鼠并收集血、尿和组织标本,检测血尿指标变化;PAS染色观察肾组织病理改变;免疫组化染色观察NLRP3蛋白的表达和分布;运用Real-time PCR和Western Blot技术检测肾组织中NLRP3炎性小体组分和炎症因子的表达水平。体外实验中,运用不同时间的缺氧刺激HK-2细胞,观察NLRP3炎性小体的表达;激光共聚焦显微镜检测HK-2细胞内NLRP3的表达,线粒体来源ROS的表达,线粒体膜电位的变化,以及NLRP3与线粒体的共定位情况;使用si RNA技术沉默TXNIP或NLRP3,观察缺氧复氧损伤后HK-2细胞内NLRP3炎性小体的表达;运用线粒体特异性ROS清除剂Mito TEMPO干预HK-2细胞,观察缺氧复氧损伤后HK-2细胞内NLRP3炎性小体的表达。2.在NLRP3炎性小体在Ang Ⅱ灌注诱导肾损伤的作用研究中,我们运用成年雄性野生型、AT1R敲除或NLRP3敲除小鼠构建Ang Ⅱ灌注损伤模型。28天后处死小鼠并收集血、尿和组织标本,检测血尿指标变化;PAS染色观察肾组织病理改变;免疫组化染色观察NLRP3蛋白的表达和分布;运用Real-time PCR和Western Blot技术检测肾组织中NLRP3炎性小体组分和炎症因子的表达水平。体外实验中,运用不同浓度的Ang Ⅱ刺激HK-2细胞,与不同时间点收集细胞,观察NLRP3炎性小体的表达;激光共聚焦显微镜检测HK-2细胞内NLRP3的表达,线粒体来源ROS的表达,线粒体膜电位的变化,以及NLRP3与线粒体的共定位情况;使用si RNA技术沉默AT1R或NLRP3,观察Ang Ⅱ刺激后HK-2细胞内NLRP3炎性小体的表达;运用线粒体特异性ROS清除剂Mito TEMPO干预HK-2细胞,观察Ang Ⅱ刺激后HK-2细胞内NLRP3炎性小体的表达。3.运用巨噬细胞特异性TNF敲除小鼠和T细胞特异性TNF敲除小鼠构建Ang Ⅱ灌注模型,收集肾组织进行Realtime PCR检测,观察TNF特异性敲除对肾组织内NLRP3炎性小体活化的影响。结果:1.与对照组相比,缺血再灌注损伤组小鼠肾功能显著下降,尿液NGAL表达升高,肾小管损伤显著,管腔内有大量管型生成,肾组织内NLRP3炎性小体显著激活。NLRP3敲除可减轻缺血再灌注损伤后的肾脏损伤,抑制肾组织内NLRP3炎性小体的活化,减少下游炎症因子的表达。2.体外实验中,缺氧复氧损伤引起HK-2细胞内炎症因子的表达增加,NLRP3炎性小体活化,线粒体膜电位下降和ROS生成增多。线粒体特异性ROS清除剂Mito TEMPO显著减轻缺氧复氧损伤引起的线粒体功能障碍,抑制NLRP3炎性小体的活化。3.与对照组相比,Ang Ⅱ灌注野生型小鼠肾功能显著下降,尿液NAG表达升高,肾小管管腔内有管型生成,肾组织内NLRP3炎性小体显著激活。AT1R敲除或NLRP3敲除可减轻缺血再灌注损伤后的肾脏损伤。Mito TEMPO干预显著减轻Ang Ⅱ灌注诱导的肾脏损伤,抑制肾组织内NLRP3炎性小体的活化,减少下游炎症因子的表达。4.体外实验中,Ang Ⅱ刺激引起HK-2细胞内炎症因子的表达增加,刺激NLRP3炎性小体活化,引起线粒体膜电位下降和ROS生成增多。AT1R沉默阻断Ang Ⅱ刺激诱导的NLRP3炎性小体活化,而AT2R沉默对NLRP3炎性小体活化无显著影响。线粒体特异性ROS清除剂Mito TEMPO显著减轻缺氧复氧损伤引起的线粒体功能障碍,抑制NLRP3炎性小体的活化。5.巨噬细胞特异性TNF敲除和T细胞特异性TNF敲除对Ang Ⅱ灌注引起的小鼠肾组织炎症和NLRP3炎性小体活化无显著影响。结论:急、慢性肾损伤中均存在小管上皮细胞损伤和肾脏炎症反应。该过程可能与NLRP3炎性小体活化有关,而线粒体功能障碍可能是NLRP3炎性小体活化、进而引起急慢性肾损伤的重要机制,此发现为急、慢性肾脏病的临床防治提供了新的治疗靶点和理论依据。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

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本文编号：2630920