NOX4调控NLRP3炎性体表达在高糖诱导足细胞凋亡中的作用

发布时间：2020-05-18 19:08

【摘要】：背景与目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以血糖代谢紊乱为特征的常见慢性疾病,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病严重的微血管并发症,目前已经成为西方国家及我国一线城市终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)的首位病因。高血糖作为DN发病的核心环节,可激活氧化应激和炎症反应介导足细胞凋亡,但具体机制仍不清楚。炎性小体这个概念由Tschopp研究小组于2002年首次提出,由核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族成员NLRP3、衔接蛋白-凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)及效应蛋白-半胱天冬酶-1(caspase-1)组成的蛋白复合物,参与2型糖尿病、动脉粥样硬化症等疾病的发生发展。正常情况下,NLRP3炎性体处于静止状态,多种内源性物质如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、尿酸晶体、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、β-淀粉样蛋白和溶酶体酶等和外源性物质明矾、石棉和二氧化硅等均可激活NLRP3炎性体,NLRP3快速结合ASC进而活化caspase-1,参与调控IL-1β、IL-18、IL-33等促炎因子的分泌。NLRP3炎性体在多种肾脏固有细胞中表达,参与糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis,FGGS)、IgA肾病、急性肾损伤和急性肾盂肾炎等多种肾脏疾病的发生发展。氧化应激是体内氧化还原反应失衡致活性氧化物(以ROS为主)产生多于清除的的病理状态,参与糖尿病肾病的起病和发展。ROS主要来源于线粒体,也可来源于黄嘌呤氧化还原酶、环加氧酶、脂氧合酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(tinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶等,其中NADPH氧化酶主要在肾脏表达,是肾皮质ROS生成的主要来源。NLRP3炎性体的激活途径主要包括:1)细胞内钾外流;2)溶酶体途径;3)ROS产生。其中ROS逐渐成为NLRP3炎性体激活的共同途径。研究表明高同型半胱氨酸血症(hHcys)刺激NADPH氧化酶衍生大量ROS触发NLRP3炎性体的形成和活化,从而产生IL-1β和其他因子致足细胞损伤。然而尚未见NOX4诱导NLRP3炎性体激活是否参与高糖诱导的足细胞凋亡的报道。本课题以人肾小球足细胞(human glomerular podocyte,HPC)为研究对象,体外高糖环境模拟机体内糖尿病条件,观察高糖和NOX4特异性抑制剂GKT137831对人肾小球足细胞凋亡的影响,进而探讨NOX4介导的NLRP3炎性体激活参与足细胞的凋亡的可能机制。从而探寻早期糖尿病肾病的发生机制及延缓糖尿病肾病进展的新治疗靶点。方法体外常规培养HPC,实验分组为:1,正常糖组;2,甘露醇组;3,高糖组;4,高糖+抑制组。高糖浓度及抑制剂浓度根据预实验结果设定。实验结束后荧光显微镜检测足细胞ROS表达;流式细胞术检测足细胞凋亡率。Western-Blot法检测NOX4蛋白、NLRP3炎性体蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)、足细胞特异性蛋白(nephrin、podocalyxin)和凋亡相关蛋白(Bcl-1、Bax)的表达。结果与正常糖组相比,高糖增加足细胞内NOX4和NLRP3表达增加,差异具有统计学意义(P0.05)。与正常糖组相比,高糖组足细胞内ROS表达增加,炎性体相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)和凋亡蛋白Bax表达增加,而足细胞结构蛋白(nephrin、podocalyxin)和抗凋亡蛋白Bcl-1表达减少,同时足细胞凋亡率增加;GKT 137831预处理能减弱足细胞内ROS表达,降低炎性体相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)和凋亡蛋白Bax表达水平,部分恢复足细胞结构蛋白(nephrin、podocalyxin)和抗凋亡蛋白Bcl-1的表达,减低足细胞凋亡率。结论1.高糖诱导人肾小球足细胞NOX4高表达和NLRP3炎性体激活。2.抑制足细胞NOX4活性可减轻高糖诱导的氧化应激和炎症反应,降低高糖诱导的足细胞凋亡。
【图文】：

A B图 1 高糖和 GKT137831 对足细胞增殖的影响注：葡萄糖呈浓度依赖性抑制人肾小球足细胞的增殖，葡萄糖浓度越高，对人肾小球足细胞的生长抑制作用越明显，实验选取葡萄糖浓度 30mmol/l，即 IC25；GKT137831 可减弱葡萄糖对人肾小球足细胞的增殖毒性作用，在 20uM 时保护作用最明显（*P<0.05）。

A B图 2 高糖诱导 NOX4 和 NLRP3 炎性体高表达注：1，，正常糖组 2，甘露醇组 3，高糖组。Westeron Blot 结果显示高糖诱导足细胞内NOX4、NLRP3 高表达，差异具有统计学意义（＊P<0.05）。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9

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本文编号：2670188