MiR-212调控HMGA2表达对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响

发布时间：2020-05-23 20:04

【摘要】：膀胱癌为我国最常见的泌尿系恶性肿瘤,其发病率排在全世界恶性肿瘤的第6位,致死率排在第9位。其主要发生在膀胱移行上皮细胞,并且直接暴露于尿液,也称为尿路上皮癌,膀胱癌中约70-75%为非肌层浸润性(NMIBC),25-30%为肌层浸润性(MIBC)。非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)的5年生存率可达90%以上。而肌层浸润性膀胱癌的25~30%患者当中,约5%已有远处转移,并且相当比例(25%)的区域淋巴结已有转移。局部晚期或转移性病灶患者的5年生存率约为15%。其治疗方法包括手术、膀胱灌注化疗药物及免疫治疗等。膀胱镜为检测膀胱癌的有效工具。然而,该项检查后容易出现一系列并发症。为了更好的对膀胱癌进行诊断和治疗随访,需要开发更加准确的生物标志物。miRNA(MicroRNA)是一类非编码小RNA分子,长度为17~25个核苷酸,它能通过碱基配对的方式与靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)互补结合,从而调控靶基因的表达。研究表明,miRNA在多种恶性肿瘤中异常表达,可以控制很多癌症相关过程,比如细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭。因此,探讨膀胱癌中miRNA的表达及对生物学功能的影响,对进一步探索膀胱癌的发病机制,寻找新的靶点,具有重要意义。目的:观察膀胱癌组织中miR-212的表达以及观察上调miR-212后对癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响,研究miR-212是否通过调控HMGA2实现其作用。方法:取31例膀胱癌患者的膀胱癌病理组织标本及配对癌旁正常组织,采用逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-212和HMGA2的mRNA表达。用免疫组化法检测HMGA2蛋白在膀胱癌及癌旁组织中的表达。人膀胱癌细胞T24分为miR-212组(转染miR-212 mimics)以及对照组(转染空白对照miR-212 NC)。在培养48 h后,用MTT比色法来检测膀胱癌细胞的增殖能力,用Transwell实验检测癌细胞的侵袭及迁移能力,划痕实验检测癌细胞的迁移能力,采用Western blotting法检测膀胱癌细胞HMGA2蛋白表达。通过生物信息学网站预测miR-212的下游靶基因,并用荧光素酶报告基因验证HMGA2是否为miR-212的直接靶基因。结果:膀胱癌组织中miR-212 mRNA表达低于癌旁正常组织(P0.05)。膀胱癌组织中HMGA2 mRNA表达高于癌旁正常组织(P0.05)。miR-212组细胞增殖、侵袭以及迁移能力均低于对照组(P均0.05)。miR-212组HMGA2蛋白表达低于对照组(P0.05)。在线数据库结合荧光素酶报告实验预测并且验证了HMGA2是miR-212的下游靶基因。结论:膀胱癌组织中的miR-212呈低表达,而miR-212过表达可以抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,其作用同HMGA2密切相关。
【图文】：

图 6 pMIR-REPORT TM 质粒图谱2.2.6 上调 miR-212 对膀胱癌细胞 HMGA2 表达的影响蛋白提取1）当转染 miR-212 表达质粒的细胞处于生长对数期时，除去培养基，用 4℃PBS 洗 2 次。2）加胰消化 3min，在显微镜下见细胞充分离壁后，加入含血清培养基终止消化，将其转移至 15mL 离心管，800rpm 离心 3min，弃上清液。3）PBS 1mL 重悬细胞沉淀，后转移至 1.5mL EP 管内，再次 800rpm 离心 3m弃上清液。4）RIPA:磷酸化酶抑制剂：将 PMSF 按 100:1:1 配置为 RIPA 工作液，置于 4℃箱待用。5）取上述 RIPA 工作液 75μL 加入细胞中，超声 3 次，每次 5s，充分混匀置于冰上反应 15min，待其充分裂解。

3.1 免疫组化结果表明 HMGA2 在膀胱癌组织中高表达HMGA2 蛋白主要定位于细胞核和细胞质，阳性染色为棕黄色。在 31 例膀胱尿路上皮癌中 HMGA2 阳性表达 17 例，，阴性表达 14 例，阳性率 54.8%；31 例癌旁组织中 HMGA2 阳性表达 3 例，阴性表达 28 例，阳性率 9.7%（见表 1）。结果表明，与癌旁组织相比，HMGA2 在膀胱癌组织中的表达显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果见图 2。表 1 HMGA2 在不同组织中表达情况组别例数 HMGA2病例数 阳性表达 (%) 阴性表达 (%) χ2值 p 值膀胱癌组 31 17(54.8%) 14(45.2%)癌旁组 31 3(9.7%) 28(90.3%) 14.467 0.000
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14

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