PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-26 09:31

【摘要】：肾缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)起病急、进展快,是临床上引起急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)的重要原因,其易转变为慢性肾功能不全,死亡率高,且近年来发病率逐年递增。肾IRI的发病机制复杂,多种机制参与了其发生发展,对其防治带来困难,目前治疗的药物仅限于对症治疗,对肾功能的改善有限。因此找到参与肾IRI损伤的关键分子用于肾IRI的防治具有重要的理论意义和实际应用价值。PDCD4(Programmed Cell Death 4,程序性细胞死亡因4),是重要的抑癌基因,关于PDCD4的研究主要集中于肿瘤相关疾病中,而在肾缺血再灌注损伤中的作用及深入机制尚不明确。大量研究表明PDCD4主要通过与靶基因mRNA编码区域结合,抑制靶基因的转录翻译过程,进而影响细胞生物学功能,影响许多肿瘤及相关疾病的发展进程。最新研究发现,PDCD4与糖脂代谢及炎症关系密切,提示PDCD4有可能在其他生理或病理情况下发挥重要作用。同时,大量研究表明,肾小管细胞死亡和炎症相互促进的过程在急性肾损伤时发挥关键作用,PDCD4在肾缺血再灌注损伤中是否发挥重要作用及具体机制值得进一步深入探讨。研究目的:1.通过体内动物实验和体外细胞实验明确PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用及机制。2.阐明PDCD4在肾缺血再灌注损伤中发挥作用的分子机制,找到参与肾缺血再灌注损伤发生发展的关键靶点,用于肾缺血再灌注损伤的临床防治。方法:第一部分:PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的表达分布及作用1.1 PDCD4在缺血再灌注损伤中的表达变化及作用1.1.1 PDCD4在C57BL/6J野生型(WT)小鼠不同组织器官及肾脏不同细胞系中的表达蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测C57BL/6J小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小肠、睾丸中PDCD4蛋白表达,同时检测肾脏不同细胞系,即大鼠肾小球系膜细胞(RMC)、大鼠肾小球内皮细胞(GENC)、人足细胞(HPC)、大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中PDCD4的蛋白表达。1.1.2建立小鼠肾缺血再灌注损伤疾病模型,检测PDCD4的表达变化选用12周龄C57BL/6J雄性鼠建立急性肾缺血再灌注模型,应用实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)、WB、免疫组化染色(Immunohistochemical-staining,IHC),分别检测PDCD4在缺血再灌注后不同时间点,即24h、48h、72h时mRNA和蛋白水平的表达变化。同时通过免疫荧光(Immunofluoresce,IF)双标的方法检测PDCD4在肾脏近曲小管、远曲小管、集合管的表达分布情况及肾缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)时的表达变化。1.1.3检测PDCD4在急性肾小管坏死病人肾脏中的表达情况IHC检测临床上肾癌病人癌旁组织切片与急性肾小管坏死病人肾活检切片中PDCD4的表达水平与分布。1.1.4体外构建不同的缺氧损伤模型检测PDCD4的表达变化使用NRK-52E通过不同刺激方法,体外模拟肾缺血再灌注损伤,主要采用三种实验方法:①糖氧剥夺实验(OGD),即采用无糖无血清培养基在缺氧条件下培养细胞2h后,换成正常培养基继续培养,收24h,48h,72h的细胞进行检测;②细胞用含有抗霉素A和2-缺氧葡萄糖(AA/2-DG)的无血清培养基培养60min后换成正常培养基继续培养24h,48h及72h;③细胞在含有50μm,200μm和500μm氯化钴的完全培养基中培养24h。WB检测在这三种体外缺氧损伤条件下,PDCD4蛋白水平的表达变化。1.2 PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用及机制1.2.1 PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用将C57BL/6JWT雄性小鼠和PDCD4-/-敲基因小鼠随机分组,构建肾急性缺血再灌注损伤疾病模型。在缺血45min后再灌注不同时间点取材,利用高效液相色谱法(HPLC)检测血清中肌酐含量、全自动生化分析仪检测血清中尿素氮含量、苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、原位末端转移酶标记技术(TUNEL染色)等方法明确PDCD4在肾脏缺血再灌注损伤中的生物学作用。1.2.2 PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用机制Real-time RT-PCR检测WT和PDCD4-/-小鼠对照组与模型组肾脏组织中代表性炎症因子IL-1β,TNF-α,IL-6及MCP-1的mRNA变化。CD68标记巨噬细胞,Ly6B标记中性粒细胞,应用IF检测WT与PDCD4-/-小鼠对照组与模型组肾脏组织中的巨噬细胞及中性粒细胞的分布及变化。第二部分PDCD4通过调控Fgr-Notch1信号通路引起肾缺血再灌注损伤2.1 PDCD4通过Fgr参与肾缺血再灌注损伤2.1.1体内验证PDCD4通过Fgr调控肾脏缺血再灌注损伤通过基因芯片技术分析肾缺血再灌注损伤时WT和PDCD4-/-小鼠间的差异表达基因,并绘制差异基因表达变化热图。Real-time RT-PCR、WB和IHC检测WT和PDCD4-/-小鼠对照组与模型组肾脏组织中Fgr mRNA及蛋白水平变化。2.1.2体外OGD验证PDCD4通过Fgr调控肾脏缺血再灌注损伤Real-time RT-PCR及WB检测OGD后不同时间点Fgr的变化,同时沉默PDCD4后Fgr mRNA及蛋白水平的变化。通过体外过表达PDCD4后沉默Fgr,应用Real-time RT-PCR检测细胞因子的变化,应用流式及Caspse3活性检测,明确PDCD4体外对肾小管细胞炎症和凋亡的影响是否通过Fgr。2.2 PDCD4通过Fgr调控Notch1信号通路2.2.1体内外验证PDCD4通过Fgr调控Notch1信号通路Real-time RT-PCR、WB和IHC检测WT和PDCD4-/-小鼠对照组与模型组肾脏组织中Notch1 mRNA及蛋白水平变化。体外实验通过WB检测OE-PDCD4后siRNA-Fgr对NRK-52E细胞中Notch1蛋白表达水平的影响,明确PDCD4是否通过Fgr调控Notch1。2.2.2小鼠肾脏局部过表达Fgr可逆转PDCD4缺失在肾缺血再灌注损伤中的保护作用将WT和PDCD4-/-敲基因小鼠随机分组,局部注射过表达带GFP标签的Fgr腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)即AAV-Fgr-GFP,一个月后建立肾缺血再灌注损伤模型。在缺血45min后不同的再灌注时间点取材,HPLC检测血清中肌酐含量、全自动生化分析仪检测血清中尿素氮含量、HE染色、TUNEL染色等方法明确过表达Fgr是否可以逆转PDCD4缺失在急性缺血再灌注损伤中的保护作用。Real-time RT-PCR检测细胞因子的表达,WB检测下游基因Notch1的表达。结果:第一部分:PDCD4在急性肾缺血再灌注损伤中的表达分布及作用1.1 PDCD4在肾缺血再灌注损伤组织中表达显著升高1.1.1 PDCD4在WT小鼠不同器官组织以及肾脏细胞系中的表达变化WB检测结果显示PDCD4在WT小鼠肾脏中表达丰富,进一步检测肾脏各细胞系结果显示:与RMC、GENC、HPC相比PDCD4在NRK-52E中表达更丰富,提示其可能在肾脏中发挥重要作用。1.1.2小鼠肾缺血再灌注损伤后PDCD4在近曲小管和集合管中表达显著升高Real-time RT-PCR结果显示在缺血再灌注损伤后48h,72h PDCD4在mRNA水平显著升高,同时WB以及IHC结果显示与WT组相比PDCD4蛋白表达显著升高。免疫荧光双标结果显示,在肾缺血再灌注损伤时PDCD4主要在近曲小管和集合管中蛋白表达显著升高。1.1.3 PDCD4在急性肾小管坏死病人肾活检标本中的表达显著升高IHC结果显示,与肾癌癌旁组织相比急性肾小管坏死病人肾活检切片中PDCD4表达显著升高。1.1.4 PDCD4在体外缺氧模型中表达显著升高WB结果显示,PDCD4在OGD,AA/2-DG,CoC12三种刺激条件下,PDCD4蛋白表达均显著升高。1.2 PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用及机制1.2.1 PDCD4的缺失显著减轻肾缺血再灌注损伤与WT小鼠相比,PDCD4-/-小鼠在缺血再灌注损伤后48h,血清中肌酐、尿素氮含量明显降低;HE染色结果显示,PDCD4缺失后肾脏形态学损伤减轻,主要表现为肾小管上皮细胞空泡样变性减少,肾小管扩张程度减轻,管型形成减少;TUNEL染色结果显示,PDCD4缺失后肾小管上皮细胞的死亡显著减少。1.2.2 PDCD4通过介导炎症反应加重肾缺血再灌注损伤Real-time RT-PCR结果显示,PDCD4缺失后,肾缺血再灌注组肾脏组织中炎症因子mRNA表达显著减少;IF结果显示,PDCD4缺失后,肾脏组织中中性粒细胞、巨噬细胞的浸润显著减少。第二部分PDCD4通过调控Fgr-Notch1信号通路引起肾缺血再灌注损伤2.1 PDCD4通过Fgr调控肾缺血再灌注损伤2.1.1体内实验结果显示PDCD4通过Fgr调控肾缺血再灌注损伤基因芯片结果分析显示,在肾缺血再灌注损伤时,Fgr显著升高,而PDCD4的缺失可以显著下调Fgr,提示PDCD4加重肾缺血再灌注损伤可能是通过Fgr发挥作用。进一步通过Real-time RT-PCR、WB和IHC验证,得出了与基因芯片一致的结论。2.1.2体外OGD实验表明PDCD4通过Fgr调控肾小管细胞的炎症和凋亡OGD后不同时间点,Real-time RT-PCR及WB结果显示,Fgr在mRNA及蛋白表达显著升高,同时沉默PDCD4后Fgr在mRNA及蛋白水平上显著下降。体外过表达PDCD4后沉默Fgr,在OGD条件下Real-time RT-PCR检测细胞因子的结果提示沉默Fgr可显著抑制PDCD4引起的NRK-52E细胞炎症因子的表达,流式及Caspse3活性检测结果表明沉默Fgr可显著抑制过表达PDCD4对NRK-52E细胞凋亡诱导。2.2 PDCD4通过Fgr调控Notch1信号通路2.2.1体内外实验结果显示PDCD4通过Fgr调控Notch1信号通路基因芯片结果分析显示,在肾缺血再灌注损伤时,Notch1表达显著升高,PDCD4的缺失显著抑制了缺血再灌注损伤诱导的Notch1表达。体内进一步用Real-time RT-PCR、WB和IHC进行验证得到了与芯片一致的结果。体外实验结果显示,ODG条件下Notch1在mRNA和蛋白表达水平上均显著升高,siRNA-Fgr可显著下调Notch1表达。体内外实验结果提示,PDCD4可能通过Fgr调控Notch1信号通路。2.2.2小鼠肾脏局部过表达Fgr可逆转PDCD4缺失在肾缺血再灌注损伤中的保护作用局部注射过表达带GFP标签的Fgr腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)即AAV-Fgr-GFP,WB结果显示,一个月后与对照组相比AAV-Fgr-GFP组Fgr表达显著升高。血清肌酐、尿素氮、HE染色、TUNEL染色、炎症因子检测等结果显示,过表达Fgr可逆转PDCD4缺失在肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用。结论与创新性1.阐述了PDCD4在肾缺血再灌注损伤中的作用,实验结果表明在肾缺血再灌注损伤中,敲除PDCD4可以通过减轻炎症细胞的浸润和炎性因子的释放,减少小管上皮细胞的凋亡减轻急性肾损伤。2.本实验首次发现PDCD4可能是通过Fgr-Notch1信号通路调控肾缺血再灌注损伤,明确了PDCD4通过调控Fgr影响Notch1的表达来加重急性肾损伤的疾病进程,为寻找防治急性肾损伤作用靶点提供了重要的理论支持和实验基础。
【图文】：

细胞系,肾脏,脏器,小鼠

细胞系即ＲＭＣ、ＧＥＮＣ、ＨＰＣ、ＮＲＫ－５２Ｅ中ＰＤＣＤ４的蛋白表达，，实验结果逡逑明，ＰＤＣＤ４在肾脏组织中表达丰富（图１．１．１ａ）。与肾脏其他细胞系相比，逡逑ＤＣＤ４在ＮＲＫ－５２Ｅ细胞中表达更丰富（图１．１．１ｂ）。提示其在肾脏可能中发挥逡逑要的作用。逡逑

硕士学位论文,近曲小管,集合管,山东大学

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑ｃａｌｂｉｎｄｉｎＤ２８ｋ、ＡＱＰ３进行免疫荧光双标，其中ＰＤＣＤ４显示绿色，标记蛋白显逡逑示红色。结果显示，发生缺血再灌损伤时，ＰＤＣＤ４在近曲小管与集合管中表达逡逑升高明显（图１．１．２ｄ）。逡逑ａ邋＾邋５－１逦＊逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

【相似文献】