~1MiR-155通过调控MAPK信号通路参与TGF-β1诱导足细胞损伤的分子机制研究

发布时间：2020-05-28 10:58

【摘要】：目的:探讨微小RNA-155(microRNA-155,miR-155)在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的足细胞损伤中的调控作用及其相关的分子机制,为肾小球疾病的诊断和治疗提供新思路。方法:(1)用TGF-β1诱导体外培养的条件永生化小鼠足细胞,将细胞随机分为:正常对照组;24h TGF-β1处理组(使用12ng/ml TGF-β1处理24h);48h TGF-β1处理组(使用12ng/ml TGF-β1处理48h);72h TGF-β1处理组(使用12ng/ml TGF-β1处理72h);4ng/ml TGF-β1处理组(使用4ng/ml TGF-β1处理72h);8 ng/ml TGF-β1处理组(使用8 ng/ml TGF-β1处理72h);12ng/ml TGF-β1处理组(使用12ng/ml TGF-β1处理72h)。利用CCK8法检测细胞增殖活力,ELISA法检测细胞上清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白细胞介素(interleukin,IL)-6蛋白的表达,RT-q PCR和Western blot法检测synaptopodin和CD2AP的表达,RT-q PCR法检测miR-155的表达;(2)miR-155过表达载体及低表达载体转染后,RT-q PCR法验证miR-155转染效率,ELISA法检测TNF-α和IL-6蛋白的表达,RT-q PCR和Western blot法检测synaptopodin和CD2AP的表达;(3)12ng/ml TGF-β1诱导足细胞后,在不同时间点用Western blot法检测p38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,erk)MAPK通路的激活情况;使用20μmol/L SB203580和20μmol/L U0126作用足细胞2h后,RT-q PCR和Western blot法检测synaptopodin和CD2AP的表达,RT-q PCR法检测miR-155的表达;(4)生物信息学分析预测miR-155与可能靶基因双特异性蛋白磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)7 3’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)的结合位点,双荧光素酶报告基因检测DUSP7基因活性,转染miR-155表达载体后RT-q PCR法检测DUSP7 m RNA的表达,Western blot法检测p38 MAPK通路和erk MAPK通路的激活情况。结果:(1)与正常对照相比,4ng/ml TGF-β1诱导足细胞48h后足细胞增殖活性降低,并且随干预时间延长、作用浓度升高而下降,差异均有统计学意义(P0.01);4ng/ml TGF-β1诱导足细胞上清TNF-α、IL-6表达上升,在12ng/ml TGF-β1诱导72h后达到最高值,差异均有统计学意义(P0.01);48h TGF-β1处理组、72h TGF-β1处理组、8 ng/ml TGF-β1处理组及12ng/ml TGF-β1处理组中synaptopodin、CD2AP m RNA和蛋白表达降低,miR-155的表达升高,差异均有统计学意义(P0.05);(2)与TGF-β1处理组相比,高表达足细胞中的miR-155后,TNF-α、IL-6表达进一步升高(P0.01),synapotodin、CD2AP m RNA和蛋白表达下调,miR-155低表达则产生相反的作用,差异均有统计学意义(P0.05);(3)与正常对照组相比,12ng/ml TGF-β1激活p38 MAPK通路和erk MAPK通路,差异有统计学意义(P0.05);与TGF-β1处理组相比,TGF-β1+SB203580组、TGF-β1+U0126组中synaptopodin、CD2AP的m RNA和蛋白均表达升高,TGF-β1+U0126组中miR-155的相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05);(4)生物信息学分析预测miR-155与DUSP7 3’UTR区存在相互作用的结合位点,双荧光素酶报告基因检测示细胞+pre-miR-155+WT-3’UTR组的荧光信号比值较空白细胞组低,差异有统计学意义(P0.05);过表达miR-155可明显降低足细胞中DUSP7m RNA的相对表达量,差异有统计学意义(P0.01);与TGF-β1处理组相比,TGF-β1+pre-miR-155组中p38及erk MAPK通路磷酸化水平升高,而TGF-β1+miR-155sponge组则降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:(1)MiR-155在TGF-β1诱导的足细胞损伤中表达上调,并与TGF-β1作用时间和剂量呈相关性;(2)miR-155与足细胞损伤密切相关,高表达miR-155促进了TGF-β1诱导的足细胞损伤,低表达miR-155可逆转这一过程;(3)miR-155可通过调控MAPK信号通路参与TGF-β1诱导的足细胞损伤。
【图文】：

图 2-1 足细胞增殖活力注：与正常对照组相比较，，#P＜0.01Figure 2- 1 Cell survival rate of podocyteNote: Compared with the normal control group,#P＜0.01上清炎症因子表达的影响清液，使用 ELISA 法检测上清液中炎症因子的蛋24 小时后细胞上清中 TNF-α、IL-6 等炎症因子的F-β1 诱导剂量的增加和干预时间的延长，细胞上清l TGF-β1 诱导足细胞 72 小时后达到最高值。差异

图 2-3 TGF-β1 诱导足细胞后 synaptopodin、CD2AP mRNA 的表达注：与正常对照组相比较，*P＜0.05，#P＜0.01Figure 2- 3 Expression of synaptopodin and CD2AP mRNA in podocytes induced by TGF-βNote: Compared with the normal control group, *P＜0.05,#P＜0.01F-β1 对足细胞 synaptopodin、CD2AP 蛋白表达的影响用 western blot 法检测 TGF-β1 诱导的足细胞中 synaptopodin、CD2AP 蛋测结果示：与正常对照组相比，24h TGF-β1 处理组、4 ng/ml TGF-β1 topodin、CD2AP 的蛋白无明显变化，当 TGF-β1 浓度达到 8ng/ml，干预时时后足细胞中 synaptopodin、CD2AP 蛋白的表达下降，并呈剂量和时间依统计学意义（P＜0.05）。这与足细胞中 synaptopodin、CD2AP mRNA 的
【学位授予单位】：右江民族医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

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本文编号：2685142