中介素对缺氧损伤肾小球内皮细胞血管生成的作用

发布时间：2020-05-28 19:00

【摘要】：目的:探索缺氧损伤后中介素IMD(intermedin)对大鼠肾小球内皮细胞rRGECs(rat renal glomerular endothelial cells)血管生成的影响及机制。方法:1.常规情况下培养、传代rRGECs;2.将RGECs随机分为2组:Ⅰ.正常对照组(N组):二氧化碳培养箱(5%CO2+95%空气)中培养;Ⅱ.缺氧组:三气培养箱(5%CO2+90%N2+5%O2)中培养,缺氧6h~([1,2]);并随机分为5组;(1)缺氧组(H组);(2)缺氧+IMD组(M0组):在缺氧组基础上加入IMD(0.1μmol/L)~([1]);(3)缺氧组+IMD+PD98059组(M1组):制作缺氧+IMD组前培养基中加入胞外信号调节激酶(extemal Signal Regulated Kinase,ERK)酶抑制剂(PD98059,5uM)~([3]);(4)缺氧+IMD组+LY-294002组(M2组):制作缺氧+IMD组前培养基中加入磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3 Kinase,PI3K)酶抑制剂(LY-294002,100uM)~([3]);(5)缺氧+IMD组+L-NAME组(M3组):制作缺氧+IMD组前培养基中加入一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)酶抑制剂(L-NAME,10uM)~([3]);3.用MTT(噻唑蓝)比色法检测各组细胞增殖情况;4.小管形成实验检测管腔样结构成环数、分支数、管腔长度;5.Western blot法检测PI3K、AKT、eNOS总蛋白及磷酸化水平;6.Western blotting法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、磷酸化血管内皮细胞生长因子受体2(phosphorylation vascular endothelial growth factor receptor 2,p-VEGFR2)蛋白表达。结果:(1)rRGECs存活率检测:与正常对照组相比,缺氧组、IMD组吸光度值下降;但IMD组较缺氧组各组吸光度值均升高,差异有统计学意义(p0.05);与M0组相比,MI组、M2组吸光度值均降低,p0.05,M3组无明显变化;与M1组相比,M2组吸光度值无差异,M3组吸光度值升高,p0.05;与M2组相比,M3组吸光度值升高,p0.05。(2)管腔样结构检测:正常对照组、缺氧组、IMD组管腔样结构成环数、分支数、管腔长度依时间梯度12小时、24小时和48小逐渐下降,p0.05。随着时间延长,内皮细胞间连接逐渐松弛,管腔样结构逐渐退化,48小时管腔样结构基本崩解,三组各指标均无差异。24小时内,与正常对照组相比,缺氧组、IMD组三者均下降,p0.05;与缺氧组相比,IMD组管腔样结构分支数、管腔长度、成环数增多,p0.05,IMD组较缺氧组程度轻,p0.05;48h三组实验结果无明显差异;与M0组相比,MI组管腔成环数减低,M2组、M3组管腔样结构长度、分支数均降低,p0.05;与M1组相比,M2组、M3组管腔成环数增高,管腔样结构长度、分支数均降低,p0.05;与M2组相比,M3组管腔样结构长度、分支数均增高,p0.05。(3)IMD诱导血管生成信号转导通路变化情况:与正常对照组相比,缺氧组、IMD组VEGF表达均增多,p0.05;IMD组:M0组、MI组、M2组、M3组彼此无差异;与正常对照组相比,缺氧组、IMD组VE-cadherin表达均降低,p0.05,但IMD组VE-cadherin表达较缺氧组增多,IMD组间VE-cadherin表达无差异;与正常对照组相比,缺氧组、IMD组p-VEGFR2表达均增多,p0.05,与缺氧组相比,M2组p-VEGFR2表达无差异,M0、MI、M3组p-VEGFR2表达减少,p0.05,与M0组相比MI、M3组p-VEGFR2表达无差异,M2组表达增多,p0.05,与M1组相比,M2组p-VEGFR2表达增多,p0.05,M3组p-VEGFR2表达无差异;与M2组相比,M3组p-VEGFR2表达减少,p0.05;与正常对照组相比,缺氧组、IMD组p-ERK1/2表达减少,p0.05,与缺氧组相比,M0、M2、M3组p-ERK1/2表达增多,且彼此间无差异,而M1组表达减少,与M0组相比M1组p-ERK1/2表达减少,p0.05,M2、M3组p-ERK1/2表达无差异,与M1组相比M2、M3组p-ERK1/2表达增多,p0.05,与M2组相比M3组p-ERK1/2表达无差异;与正常对照组相比,缺氧组、IMD组p-PI3K表达减少,与缺氧组相比,M0、M1、M3组p-PI3K表达增多,M2组表达减少,与M0组相比M1、M3组p-PI3K表达无差异,M2组p-PI3K表达减少,p0.05;与M1组相比M2组p-PI3K表达减少,p0.05;M3组表达无差异,与M2组相比M3组p-PI3K表达增多,p0.05;与正常对照组相比,缺氧组、IMD组p-eNOS表达均减少,与缺氧组相比,p0.05,M0、M1、M2组p-eNOS表达增多,M3组表达减少,p0.05,与M0组相比M1组p-eNOS表达无差异,M2、M3组p-eNOS表达减少,p0.05,与M1组相比,M2、M3组p-eNOS表达减少,与M2组相比M3组p-eNOS表达减少,p0.05。结论:缺氧可降低rRGECs存活率,IMD在缺氧条件下可作用于ERK、PI3K/AKT通路增加rRGECs存活率,减轻缺氧损伤,而eNOS通路不参与这一过程;缺氧会刺激rRGECs VEGF产生增多、p-VEGFR2表达增多,IMD对VEGF表达无影响;IMD能够上调缺氧rRGECs VE-cadherin表达,降低p-VEGFR2表达;阻断PI3K通路则p-VEGFR2表达增多,机制可能是IMD通过作用于VE-cadherin/VEGFR2/PI3K复合物,减弱了VEGFR2的磷酸化,从而减弱rRGECs对VEGF刺激的应答反应,进而抑制过度出芽;IMD在诱导缺氧损伤rRGECs管腔扩增需激活ERK1/2,但不会限制血管萌发;IMD作用于PI3K/AKT/eNOS信号级联促进缺氧损伤rRGECs血管的长度及分支等生长;IMD通过对VE-cadherin和下游PI3K/AKT/eNOS和ERK1/2通道的调控,促进血管正常化生成。同时PI3K/AKT是eNOS的上游信号通路,但并非唯一通路。
【图文】：

柱状图,无差异,中介,柱状图

本研究 MTT 实验显示：与正常对照组相比，缺氧组、IMD 组随时间延长吸光度值下降；但 IMD 组较缺氧组各组吸光度值均升高；与 M0 组相比，MI 组、M2组吸光度值均降低，M3 组无明显变化；与 M1 组相比，M2 组吸光度值无差异，M3 组吸光度值升高；与 M2 组相比，M3 组吸光度值升高。见表 1、柱状图 1。表 1 中介素对缺氧 rRGECs 存活的影响（ x±s, n=3）分组干预因素 12h 24h 48hN 组－－0.68±0.01 0.91±.032 0.91±0.01H 组 H －0.42±0.013a0.54±0.01a0.55±0.01aM0 组 H/R 缺氧+IMD0.65±0.01ab0.81±0.01ab0.82±0.01abM1 组 H/R 缺氧+IMD+PD980590.52±0.01abc0.71±0.01abc0.72±0.01abcM2 组 H/R 缺氧+IMD+LY-2940020.53±0.01abc0.71±0.01abc0.72±0.01abcM3 组 H/R 缺氧+IMD+L-NAME0.63±0.01abde0.80±0.01abde0.80±0.01abde注：与 N 组相比，ap<0.05；与 H 组相比，bp<0.05；与 M0 组相比，cp<0.05；与 M1 组相比，dp<0.05；与 M2 组相比，ep<0.05

柱状图,管腔,长度,柱状图

柱状图 2 管腔长度（n=3）与 N 组相比，ap<0.05；与 H 组相比，，bp<0.05；与 M0 组相比，cp<0.05；与 M1 组相比，dp<0.05；2 组相比，ep<0.05
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

【参考文献】