褪黑素对小鼠睾丸和人精子热应激损伤的保护机制研究

发布时间：2020-05-29 07:33

【摘要】：精子发生需要阴囊的温度低于体温,研究表明阴囊温度升高将导致雄性生育力降低甚至不育。既往研究表明睾丸温度升高会诱发热应激反应,并最终导致精子发生障碍,而目前热应激导致的生精异常的详细调控机制以及如何改善热应激引起的睾丸损伤并不十分明确。热应激反应往往伴随着氧化应激的发生,而褪黑素作为神经内分泌激素,其本身以及代谢产物具有较好的抗氧化应激和抗细胞凋亡的作用。但是目前尚未有褪黑素对雄性生殖细胞热应激损伤的保护作用和机制的研究。鉴于此,本研究将从以下三方面系统阐述褪黑素在改善热应激导致的精子发生障碍的可能机制:1.鉴定褪黑素对热应激导致的小鼠睾丸精子发生异常的改善作用;2.解析褪黑素对小鼠精母细胞热应激损伤的保护作用的调节机理;3.探讨褪黑素对人精子热应激损伤的保护作用及机制。第一部分褪黑素对热应激导致的小鼠睾丸精子发生障碍的保护作用目的:探讨热应激对小鼠睾丸精子发生和附睾中精子质量的影响,以及褪黑素对小鼠睾丸和附睾热应激损伤的保护作用。方法:将小鼠分为四组:对照组(Con)、褪黑素组(Mel)、热应激组(HS)、热应激+褪黑素组(HS+Mel)。通过腹腔注射给予小鼠褪黑素,并通过将小鼠睾丸置于42°C的水浴30min建立热应激模型。采用流式细胞技术分析小鼠附睾精子氧化应激参数的差异,SCD法检测附睾精子DNA碎片率。通过ELISA检测小鼠睾丸组织的氧化应激水平,分别采用RT-PCR和Western Blot技术检测小鼠睾丸组织内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和凋亡相关分子的m RNA和蛋白水平的表达,并通过小鼠睾丸组织HE染色和TUNEL染色检测小鼠曲精小管生殖细胞的生精及凋亡状况。结果:HS组与Con组相比,小鼠附睾精子的活力和活率降低,精子的氧化应激损伤增加,精子DNA碎片率增加;小鼠睾丸组织氧化应激水平增加;睾丸组织的内质网应激相关分子GRP78、p-e IF2α、CHOP的表达增加;睾丸组织凋亡相关分子Caspase3的表达增加,Bcl-2/Bax的比值降低;睾丸组织曲精小管内各级生精细胞丢失和凋亡,而腹腔注射褪黑素,可以部分缓解热应激对小鼠附睾和睾丸造成的上述损伤。结论:褪黑素缓解热应激导致的小鼠睾丸精子发生障碍,降低小鼠睾丸细胞的氧化应激、内质网应激和凋亡;降低附睾中精子的氧化应激和DNA碎片率,提高精子质量。第二部分褪黑素对热应激导致的小鼠精母细胞损伤的保护机制目的:探讨褪黑素对小鼠精母细胞热应激损伤的保护作用的调节机理。方法:通过BSA梯度法分离出各组小鼠睾丸组织的粗线期精母细胞。在GC-2细胞系中通过在培养液中加入H2O2诱导GC-2细胞氧化应激,通过加入内质网应激诱导剂/抑制剂(衣霉素/4-PBA)诱导/抑制细胞内质网应激的产生,并采用CHOP si RNA敲除GC-2细胞系内源性CHOP的表达。通过免疫荧光、ELISA、RT-PCR和Western Blot技术检测氧化应激、ER stress和凋亡相关分子的表达。通过染色体微铺展技术和免疫荧光检测精母细胞以及GC-2细胞的DNA双链断裂(double-stand break,DSB)修复情况。结果:1.在分离的小鼠粗线期精母细胞中发现,HS组较Con组的细胞的4-HNE含量增加;精母细胞内质网应激和凋亡相关分子在m RNA和蛋白水平表达量增加。而HS+Mel组较H组精母细胞的4-HNE的含量降低,内质网应激和凋亡相关的分子的m RNA和蛋白水平上的表达降低。另外通过免疫荧光显示脂类氧化产物4-HNE与内质网相关重要蛋白CHOP,以及CHOP和凋亡蛋白c-Caspase3在热应激后的精母细胞中呈现共定位表达。在GC-2细胞系中,加入H2O2和褪黑素发现褪黑素可以缓解双氧水导致的CHOP和Caspase3的表达上调。2.通过染色体微铺展技术发现HS组的DSB标记物γ-H2AX的位点数显著高于Con组,HS+Mel组的位点数较HS组明显降低。在GC-2细胞系中,加入衣霉素后CHOP表达量升高,DNA损伤修复蛋白Rad51表达量降低。并且在同时加入衣霉素和4-PBA后发现,4-PBA抑制衣霉素引起的Rad51的表达降低。另外,通过免疫荧光检测X线照射后GC-2细胞在不同时间点的DSB修复情况,发现内质网诱导剂衣霉素抑制GC-2细胞的DSB修复。3.同样在GC-2细胞系中加入ER stress诱导剂衣霉素可以增加CHOP和Caspase3的表达,然而通过CHOP si RNA敲除GC-2细胞系内源性CHOP后,加入衣霉素后Caspase3的表达明显低于未敲除组加入衣霉素后的表达。结论:褪黑素降低热应激导致的小鼠精母细胞氧化应激和内质网应激,促进精母细胞的DSB修复,减少精母细胞的凋亡。第三部分褪黑素对热应激导致的人精子损伤的保护机制目的:探讨褪黑素能否改善热应激对人精子的损伤以及其作用机制。方法:将收集的人精液样本分为四组:对照组(Con)、褪黑素组(Mel)、热应激组(HS)、热应激+褪黑素组(HS+Mel),向Mel组和HS+Mel组加入1m M的褪黑素37°C孵育30 min,后将H组和H+M组置于42°C培养箱热处理3h,后转移至37°C培养箱。24h后,检测各组样本之间精子活力和活率的差异,以及用流式细胞技术检测各组样本精子氧化应激和凋亡指标的差异,用免疫荧光和SCD法检测各组间精子DNA氧化损伤和碎片率的差异。结果:HS组较Con组相比精子活力和活率下降,精子线粒体ROS增加,精子线粒体膜电位丢失,精子脂类氧化产物4-HNE产量增加,精子DNA氧化损伤和碎片率增加,精子凋亡率增加,而HS+Mel组与HS组相比精子活力和活率升高,精子线粒体氧化应激降低,精子线粒体膜电位丢失减弱,精子脂类氧化产物4-HNE产量降低,精子DNA氧化损伤和碎片率降低,精子凋亡率降低。结论:褪黑素作有效缓解热应激对人精子造成的氧化应激损伤,提高精子质量。
【图文】：

模式图,褪黑素,热应激,腹腔注射

图 1.1 小鼠热应激处理以及腹腔注射褪黑素的模式图1.2.2 主要实验试剂PCR 引物 TAKARA 中国去离子水 Hyclone 美国Triton X-100 上海生工生物工程公司中国胎牛血清 (BSA) Sigma 美国反转录试剂盒 TAKARA 日本多聚甲醛联发天津β-巯基乙醇 Sigma 美国CHOP 一抗 CST 美国GRP78 一抗 SCBT 美国p-eif2α一抗 CST 美国c-Caspase3 一抗 CST 美国

褪黑素,热应激,应激水平,数据表示

图 1.2 褪黑素降低热应激后小鼠睾丸组织氧化应激水平A:各组睾丸组织 MDA 水平，B:各组睾丸组织 4-HNE 水平，C:各组睾丸组织 GSH/GSSH 水平，数据表示为均数±标准差, n=3,**P<0.01，***P<0.001。1.3.3 褪黑素降低热应激引起的小鼠睾丸组织内质网应激最近有些研究表明在小鼠睾丸中，热暴露是细胞内质网应激的潜在诱导因素，通过激活未折叠蛋白反应诱导细胞凋亡28。为了研究褪黑素对热应激后小鼠睾丸内质网应激的保护作用，，本实验从 mRNA 和蛋白质表达水平检测了各组小鼠睾丸细胞的内质网应激状态。GRP78 是重要的 ER 分子伴侣蛋白，其不仅可以作为 ER stress 的传感器也是 ER stress 的重要调控者，同时还参与调控 UPR信号通路，结果显示 HS 组较 Con 组小鼠睾丸组织的 GRP78 的 mRNA 水平和蛋白水平的表达增高（图 1.3，A、C、D P<0.001，P<0.01），而褪黑素可以降低热应激诱导的睾丸组织 GRP78 的表达上调（图 1.3，A、C、D P<0.01，P<0.05）。CHOP 作为 PERK 通路和 ATF6 通路上的下游蛋白，还可以介导 ER stress 引起的细胞凋亡通路的激活，同样在 HS 组的睾丸组织中具有较高水平的表达（图
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R698.2

【相似文献】