miR-9和miR-125b在狼疮性肾炎中作用及机制的研究

发布时间：2020-05-30 14:54

【摘要】：第一部分下调的miR-9通过靶向调控STK3介导的MAPKs信号通路抑制人肾小球系膜细胞增殖并促进其凋亡背景和目的系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以自身免疫耐受遭到破坏、产生自身抗体并介导免疫损伤为特征的自身免疫性疾病,能够导致多重器官的损伤。狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)是SLE所有并发症中发病率和死亡率最高的一种。LN的主要病理特征表现为因系膜细胞紊乱导致的肾小球肾炎和肾小管间质的病变。而系膜细胞的过度增殖是LN最原始的病理改变之一。miR-9在多种恶性肿瘤中表达下调,又在某些肿瘤中表达上调。miR-9能够调控癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及白血病和神经细胞的发育,但LN的发病过程中,miR-9在肾小球中的表达及其对系膜细胞增殖和凋亡的影响和相应机制还未十分明确。前人研究表明,Toll样受体4(TLR4)在激活炎症反应过程中miR-9表达上调。而TLR4也能活化人肾小球系膜细胞(Human mesangial cells,HMCs)中的MAPKs通路促进HMCs增殖,造成肾小球损伤。因此,推测miR-9参与LN过程中HMCs过度增殖造成的肾损伤。此外,通过TargetScan数据库预测发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(STK3)是miR-9的靶基因。STK3属于MAPK相关激酶家族成员,参与多种细胞生存和凋亡的调控。由此,本研究旨在检测miR-9和STK3在LN患者肾组织和血液中的表达及相互关系,并探讨miR-9对HMCs细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法1、本研究纳入20对LN患者的肾组织和同期肾脏肿瘤的癌旁组织,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肾组织中miR-9和STK3的表达。通过western blot方法检测STK3的表达。2、同时抽取20对LN患者和健康对照人群的血液。qRT-PCR法评估血液中miR-9和STK3的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中STK3的水平。3、设计STK3的3' UTR序列的引物,经过PCR扩增回收DNA产物,酶切,连接和转化,构建psiCHECK-2-STK3 WT质粒。随后设计STK3的3' UTR序列突变的引物,以psiCHECK-2-STK3WT质粒为模板,经过PCR扩增、凝胶回收DNA产物、酶切、连接和转化,构建psiCHECK-2-STK3MT质粒。4、将 miR-9 inhibitor 和 miR-9 inhibitor NC 分别转染入 HMCs 细胞中,qRT-PCR验证miR-9的情况。qRT-PCR和western blot检测STK3的表达。最后将 psiCHECK-2-STK3 WT 和 psiCHECK-2-STK3 MT 质粒分别转染入 miR-9 mimics或miR-9 mimics NC的293T细胞中。双荧光素酶报告基因实验观察miR-9是否对STK3有调控作用。5、将 miR-9 inhibitor 和 miR-9 inhibitor NC 转染到 HMCs 后,细胞继续培养24 h、48 h和72 h后,CCK-8法检测各组细胞增殖能力。细胞转染48 h后,通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。6、采用 qRT-PCR 方法检测转染 miR-9 inhibitor 和 miR-9 inhibitor NC 的过度增殖模型的HMCs中p38、ERK和JNK的表达,并通过western blot方法明确各组细胞中p38、ERK和JNK的磷酸化水平。结果1、LN患者的肾组织中miR-9的表达显著高于对照组织(p0.05)。与对照组肾癌旁组织相比,STK3在LN患者肾组织中的mRNA水平和蛋白水平均显著减少(p0.05)。2、与健康对照组的血液样本相比,LN患者的血液中miR-9的表达明显升高(p0.001),而STK3的mRNA和蛋白水平却显著下降(p0.001)。3、扩增后在琼脂糖凝胶电泳的658 bp位置附近出现STK3基因3' UTR序列的条带。酶切鉴定的结果可见一条658 bp的目的基因条带和载体条带,表明重组质粒psiCHECK-2-STK3 WT构建成功。随后以野生型STK3基因3' UTR位点DNA为模板,将野生型STK3的3' UTR区域728-735位点突变掉,经上海生工测序,结果正确,表明重组质粒psiCHECK-2-STK3MT构建成功。4、在HMCs细胞中转染miR-9 inhibitor后,miR-9的表达较NC组降低4.08倍(p0.001),表明miR-9已在细胞中成功干扰。干扰miR-9后,STK3在mRNA和蛋白水平的表达均比NC组明显升高(p0.001),提示miR-9对STK3可能存在直接或间接的调控作用。进一步双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-9 mimics组psiCHECK-2-STK3 WT报告基因的相对荧光素酶活性较NC组显著降低(p0.01),而STK3 3'UTR序列突变后能逆转该效应。5、miR-9抑制表达之后,HMCs的增殖能力较对照组明显下降,在24h时即与inhibitor NC组形成显著性差异(p0.05),并随着时间推移,在48 h和72 h时抑制程度更加明显(p0.01)。与此同时,miR-9 inhibitor组凋亡的细胞数量是inhibitor NC 组的 3.5 倍(p0.001)。6、与 inhibitor NC 组相比,miR-9 inhibitor 组细胞中 p38 和 JNK 的 mRNA水平明显增加(p0.001),ERK的整体mRNA水平显著降低(p0.05)。miR-9 inhibitor组细胞p38和JNK的相对磷酸化水平较inhibitor NC组显著增加,而ERK的磷酸化水平却显著降低(p0.001)。结论1、miR-9在LN患者肾组织中表达上调,而LN患者肾组织中STK3在mRNA水平和蛋白水平均下调。2、miR-9在LN患者血液样本中表达上调,而LN患者血液样本中STK3在mRNA水平和蛋白水平均下调。3、增加miR-9的表达能下调STK3水平,miR-9能通过与STK3的3' UTR位点结合调控STK3的表达。4、抑制miR-9的表达能通过上调STK3来抑制HMCs细胞的增殖,促进细胞凋亡。5、抑制miR-9而上调的STK3能通过抑制ERK MAPK通路,活化p38和JNK MAPK通路来诱导HMCs的抑制增殖和促凋亡效应。综上所述,本研究明确了肾小球系膜细胞中miR-9对STK3的调控作用及其对系膜细胞增殖和凋亡能力的影响,并初步揭示了其促增殖和抑制凋亡的机制。因此,miR-9水平升高可以作为评估LN的参考指标,降低miR-9的水平有望成为LN基因治疗的潜在手段。第二部分miR-125b下调的STAT3通过ERK和p38 MAPK信号通路抑制人肾系膜细胞增殖并促进凋亡背景和目的当前LN的治疗方法主要为糖皮质激素和免疫抑制剂类药物。但该药物并非对所有患者均有效,且会产生短期或长期的毒副作用。寻找相关miRNA将有助于研发更为有效的治疗手段。多项研究表明,miR-125b在肿瘤细胞中异常表达,并与癌细胞增殖、迁移、凋亡和免疫应答密切相关。miR-125b也是免疫系统运行过程中的重要参与者,既能诱导淋巴细胞分化,又能激活免疫细胞。miR-125b在SLE患者T淋巴细胞中表达下调,并能直接上调Kruppel样因子13(KLF13)、ETS1和STAT3的表达,诱发炎症反应,并与LN的发病呈负相关。但miR-125b在LN患者肾小球系膜细胞中的表达及其对系膜细胞增殖和凋亡的影响和相关机制还未十分明确。本研究旨在检测miR-125b和STAT3在LN患者肾组织和血液中的表达、二者是否存在靶向关系,并探讨miR-125b对肾小球系膜细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法1、本研究募集20例LN患者的肾组织和20例同期肾脏肿瘤的癌旁组织,qRT-PCR方法检测肾组织中miR-125b和STAT3的表达。通过western blot方法检测STAT3的表达。2、同时采集20例LN患者和20例健康对照人群的血液。qRT-PCR法观察血液中miR-125b和STAT3的表达,ELISA检测血清中STAT3的蛋白水平。3、设计STAT3的3' UTR序列的引物,经过PCR扩增并回收DNA产物、双酶切、连接和转化实验构建psiCHECK-2-STAT3 WT质粒。随后设计突变的STAT3的3' UTR序列的引物,以psiCHECK-2-STAT3 WT质粒为模板,经过PCR扩增、凝胶回收、双酶切、连接和转化构建psiCHECK-2-STAT3MT质粒。4、将miR-125b mimics和mimics NC分别转染入HMCs或293T细胞中,qRT-PCR验证miR-125b的情况。通过qRT-PCR和western blot明确过表达miR-125b 后 STAT3 的表达。最后将 psiCHECK-2-STAT3 WT 和psiCHECK-2-STAT3 MT 质粒分别转染入 miR-125b mimics 或 miR-125b mimics NC的293T细胞中。双荧光素酶实验观察miR-125b是否对STAT3有调控作用。5、在HMCs细胞中转染miR-125b mimics和mimics NC后,细胞分别继续培养24 h、48 h和72 h后,CCK-8法检测各组细胞增殖能力。细胞转染48 h后,通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。6、通过 qRT-PCR 方法比较转染 miR-125b mimics 和 mimics NC 的 HMCs 中p38、ERK和JNK mRNA表达的变化,并通过western blot方法了解各组细胞中p38、ERK和JNK的磷酸化水平。结果1、与对照组肾癌旁组织相比,LN患者的肾组织中miR-125b的表达明显降低(p0.01),STAT3在LN患者肾组织中的mRNA水平和蛋白水平均显著升高(p0.05)。2、LN各患者的血液中miR-125b的表达均较健康对照组明显降低(p0.001),而STAT3的mR]NA和蛋白的表达却显著增加(p0.001)。3、PCR扩增后在琼脂糖凝胶电泳的320 bp位置附近出现STAT3基因3' UTR序列的条带。酶切鉴定的结果显示出一条320 bp的目的基因条带和载体条带,表明重组质粒psiCHECK-2-STAT3 WT构建成功。随后以psiCHECK-2-STAT3 WT的DNA为模板,将野生型STAT3的3' UTR区域的1438-1445位点突变掉,测序结果正确,表明重组质粒psiCHECK-2-STAT3 MT构建成功。4、miR-125b mimics 组的 miR-125b 的表达是 NC 组的 3.35 倍(p0.001),表明miR-125b已在293T细胞中成功过表达。过表达miR-125b后,STAT3在mRNA和蛋白水平的表达均较NC组明显下降(p0.001),提示miR-125b对STAT3可能存在直接或间接的调控作用。双荧光素酶报告基因实验结果进一步显示,miR-125b mimics组psiCHECK-2-STAT3 WT报告基因的相对荧光素酶活性较NC组显著降低(p0.001),而STAT3的3' UTR序列突变后能逆转该效应。5、在HMCs中,过表达miR-125b的HMCs细胞总体增殖能力较NC组明显降低(p0.01),在48 h时抑制程度最明显(p0.001)。与此同时,mimics组凋亡的HMCs细胞数量是mimics NC组的3.88倍(p0.001)。6、在HMCs中,与mimicsNC组相比,过表达miR-125b的HMCs细胞中p38mRNA水平明显增加(p0.001),ERK的整体mRNA水平显著降低(p0.01),而JNK的表达未出现明显变化。同时,过表达miR-125b的HMCs细胞p38的相对磷酸化水平较mimicsNC组显著增加(p0.001),而ERK的相对磷酸化水平显著降低(p0.01),JNK的相对磷酸化水平仍未见明显变化。结论1、miR-125b在LN患者肾组织中表达下降,而LN患者肾组织中STAT3在mRNA水平和蛋白水平均显著上升。2、miR-125b在LN患者血液样本中表达减少,而LN患者血液样本中STAT3在mRNA水平和蛋白水平均明显增加。3、过表达miR-125b能抑制STAT3的表达,miR-125b能通过与STAT3的3' UTR位点结合进而下调STAT3的表达。4、过表达miR-125b能通过下调STAT3来抑制HMCs细胞的增殖,促进其凋亡。5、过表达miR-125b下调的STAT3能通过抑制ERK MAPK通路,活化p38 MAPK通路来诱导HMCs的抑制增殖和促凋亡效应。综上所述,本研究探明了肾小球系膜细胞中miR-125b通过靶向下调STAT3的表达来抑制系膜细胞增殖并促进凋亡,初步揭示了 miR-125b抑制增殖和促进凋亡的机制。因此,miR-125b水平可以作为LN的参考监测指标,miR-125b是LN基因治疗的潜在靶标。
【图文】：

肾小球,内参

图１－１邋ｍｉＲ－９和ＳＴＫ３在组织样本中的表达逡逑Ａ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍｉＲ－９在肾小球组织中的表达。选择Ｕ６作为内参对照。与逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＴＫ３在肾小球组织中的表达。选择Ｕ６作为内参对照。与逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｃ、Ｄ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＳＴＫ３在肾小球组织中的表达。ＧＡＤＰＨ作为内参对逡逑照，数据以平均值±５口表示。与ｎｏｒｍａ丨相比，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑以上均实验重复３次。逡逑

内参,血液,肾小球

逑ｚ邋／逡逑图１－１邋ｍｉＲ－９和ＳＴＫ３在组织样本中的表达逡逑Ａ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍｉＲ－９在肾小球组织中的表达。选择Ｕ６作为内参对照。与逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＴＫ３在肾小球组织中的表达。选择Ｕ６作为内参对照。与逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｃ、Ｄ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＳＴＫ３在肾小球组织中的表达。ＧＡＤＰＨ作为内参对逡逑照，，数据以平均值±５口表示。与ｎｏｒｍａ丨相比，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑以上均实验重复３次。逡逑５１逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.242

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