西格列汀通过激活Hippo通路及调控组织蛋白酶B的表达抑制膀胱癌细胞增殖的研究

发布时间：2020-05-31 07:57

【摘要】：目的:西格列汀(Sitagliptin,Sita)是二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂,在2型糖尿病患者中可通过抑制胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的降解而改善血糖控制。有文献报道,西格列汀能抑制乳腺癌的发生及上皮细胞转化,对结肠癌也具有抑制作用,但是,目前还没有西格列汀对膀胱癌影响的相关报道。本研究采用不同浓度的西格列汀处理人膀胱癌细胞T24与5637,检测细胞生存力的变化;明确在西格列汀影响膀胱癌增殖的过程中,Hippo通路的作用;解释在西格列汀抑制膀胱癌细胞增殖过程中组织蛋白酶B(CTSB)的变化,以及组织蛋白酶B的表达对细胞增殖的影响。研究方法:1.体外培养T24与5637细胞,T24细胞给与0、0.3m M、0.6m M、1.2m M的西格列汀,5637给与0、0.5m M、1.0m M、1.5m M的西格列汀,分别处理24h、48h、72h,MTS以及平板克隆检测细胞活力。2.Western blot检测西格列汀处理后Hippo通路关键蛋白以及组织蛋白酶B的变化,包括p-LATS909、p-YAP127、CTSB。3.免疫荧光对比西格列汀处理后YAP的核定位变化。4.RT-PCR检测西格列汀处理后YAP下游靶基因变化以及CTSB的m RNA变化。5.使用YAP抑制剂verteporfin或者si RNA降低膀胱癌细胞YAP的活性后,检测CTSB的m RNA以及蛋白水平变化。6.敲低细胞CTSB表达后,CCK8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.给与不同浓度西格列汀处理T24与5637后,与对照组相比,处理组降低了细胞活力,且与对照组之间的差异有统计学意义(P0.05)。2.西格列汀处理T24与5637后,分别在不同时间点收取细胞,western blot发现p-LATS909一过性增高,p-YAP127持续增高。给与不同浓度西格列汀处理后,p-YAP127蛋白也增加,而组织蛋白酶B的蛋白表达降低。3.西格列汀处理T24与5637后,免疫荧光结果显示,与对照组相比,处理组YAP核定位减少。4.西格列汀处理T24与5637后,RT-PCR结果显示YAP下游靶基因表达减少,CTSB的m RNA表达也降低。5.抑制YAP活性或者敲低YAP后,CTSB的m RNA与蛋白水平均降低。6.敲低细胞CTSB表达后,T24及5637细胞的增殖活力明显降低,流式细胞术结果显示细胞凋亡明显增加。结论:1.西格列汀抑制了膀胱癌细胞的增殖。2.Hippo通路在西格列汀抑制膀胱癌细胞增殖过程中被激活了。3.西格列汀在抑制膀胱癌细胞增殖过程中降低了组织蛋白酶B的表达。4.YAP调控组织蛋白酶B的m RNA及蛋白表达。5.组织蛋白酶B的表达降低,增加了细胞凋亡。
【图文】：

图 3.1 西格列汀抑制膀胱癌细胞增殖A：不同浓度的西格列汀处理 T24、5637 膀胱癌细胞系不同时间后，MTS 检测细胞增殖率，B：使用西格列汀处理 T24、5637 膀胱癌细胞系后细胞克隆数。3.2 西格列汀激活 Hippo 通路为了验证西格列汀抑制膀胱癌细胞增殖过程中 Hippo 通路活性的改变，我们用western blot 检测了 Hippo 通路的相关蛋白表达。我们用 1.2mM 的西格列汀处理 T24细胞 10min、30min、1h、4h、6h、8h、12h，用 1.5mM 的西格列汀处理 5637 细胞10min、30min、1h、4h、6h，然后检测了 p-LATS909、p-YAP127，发现 T24 细胞中 p-LATS909 在 10min 时升高，5637 细胞中 p-LATS909 在 1h 时升高，p-YAP127在T24和5637中均随着西格列汀处理时间延长而升高（图3.2A）。随后我们用0mM、0.3mM、0.6mM、1.2mM 四个浓度的西格列汀处理 T24 细胞 12h，用 0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM 四个浓度的西格列汀处理 5637 细胞 6h，发现 p-YAP127 随着浓度升高而升高（图 3.2B）。随后，我们希望通过免疫荧光验证细胞内 YAP 的定位，

10min、30min、1h、4h、6h，然后检测了 p-LATS909、p-YAP127，发现 T24 细胞中 p-LATS909 在 10min 时升高，5637 细胞中 p-LATS909 在 1h 时升高，p-YAP127在T24和5637中均随着西格列汀处理时间延长而升高（图3.2A）。随后我们用0mM、0.3mM、0.6mM、1.2mM 四个浓度的西格列汀处理 T24 细胞 12h，，用 0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM 四个浓度的西格列汀处理 5637 细胞 6h，发现 p-YAP127 随着浓度升高而升高（图 3.2B）。随后，我们希望通过免疫荧光验证细胞内 YAP 的定位，发现与对照相比，用西格列汀处理后，T24、5637 细胞中 YAP 的核定位明显减少，与之前 p-YAP127 升高结果一致（图 3.2E）。随后我们对 YAP 下游靶基因进行了
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14

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本文编号：2689540