CCAT2在前列腺癌细胞系中的转录调控机制

发布时间：2020-05-31 08:20

【摘要】：目的在前列腺癌细胞系DU145中,通过检测CCAT2的含SNP位点的153bp区段G/T型启动子活性及其差异,及其启动子结合转录因子的不同,探讨长链非编码基因CCAT2的转录调控机制。方法质粒构建,以荧光素酶报告基因质粒载体pGL3-Basic-LUC和插入SV40启动子的pGL3-Promoter-LUC为基础,将课题组前期工作筛选出最短长度(153bp)的可能的CCAT2基因启动子功能区段分别以不同方向连接到上述质粒载体上以驱动报告基因表达,分别命名为pGL3-Basic-153Gs-LUC、pGL3-Basic-153Ts-LUC、pGL3-Promoter-153Ts-LUC和pGL3-Promoter-153Gs-LUC、pGL3-PromoterTRANS-153Ts-LUC和pGL3-Promoter-TRANS-153Gs-LUC。应用双荧光素酶报告基因实验方法,检测包含CCAT2的SNP位点的G/T差区段的启动子转录活性。与CCAT2基因启动子结合的候选转录因子DDX5,采用蛋白质免疫印迹(Western-Blot)方法检测其表达。采用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)联合q PCR检测该候选转录因子DDX5与CCAT2基因启动子的结合活性,以及G/T差异的该区段与DDX5的结合活性差异。结果在DU145细胞中,双荧光素酶报告基因实验结果显示,pGL3-153Gs-LUC和pGL3-153Ts-LUC构建成功,双荧光素酶报告基因实验结果显示,能够驱动报告基因表达(P0.05,P0.05)。T型CCAT2启动子驱动的报告基因相对活性高于G型(P0.05),但是与pGL3-Promoter-LUC转染组SV40启动子驱动的报告基因相对活性比较无统计学差异。在pGL3-Promoter-LUC报告基因质粒载体,插入Gs/Ts153bp启动子功能区段后,驱动报告基因的相对活性升高(P0.05);且T型CCAT2启动子驱动报告基因表达的水平高于G型(P0.05);而反向插入Gs/Ts153bp启动子功能区段驱动报告基因,其相对活性均与对照组SV40启动子驱动的报告基因相对活性无统计学差异。Western-Blot结果显示在前列腺癌细胞系DU145细胞和LNCaP细胞中DDX5蛋白均有表达;ChIP联合qPCR实验结果显示DDX5与CCAT2基因启动子具有结合活性,且结合的T型启动子结合活性高于G型(P0.05)。结论在前列腺癌DU145细胞系中,包含的rs6983267 SNP位点的长度为153bp G/T差异区段具有启动子活性,T型区段的活性高于G型;这差异可能与DDX5的差异结合有关。
【图文】：

基因,质粒

2：pGL3-Promoter-153Gs-LUC 酶切，3：moter-TRANS-153Gs-LUC 酶切，，5：pGL3-Promoter1 pGL3-Promoter-LUC 系列报告基因质粒的truction of reporter plasmids basing on pGL3-Pr

方向图,方向

- 15 -ANS-153Gs-LUC 的方向 PCR，2：pGLL3-Promoter-153Gs-LUC 连接片段 direction identification.on pGL3-Promoter-153Gs-LUC、pGL3-ProC、pGL3-Promoter--TRANS-
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25

【参考文献】