成人T2DM合并DN患者外周血IL-10表达水平及与DNA甲基化的关系

发布时间：2020-06-01 23:34

【摘要】：目的明确2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)合并糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者外周血白介素10(interleukin-10,IL-10)的表达水平及与DNA甲基化的关系,为DN抗炎及表观遗传机制的进一步阐明提供线索。方法选取2017年08月至2018年07月于新乡医学院第一附属医院肾病科及内分泌科住院的51例T2DM合并DN患者作为DN组,其中DNⅢ期21例、DNⅣ期30例。对照组:48例健康体检人员。所有入组研究对象均知情同意并签署知情同意书。收集患者一般资料及生化资料:年龄、性别、病程、血压、血肌酐、血尿素、总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、糖化血红蛋白、血钙、24小时尿蛋白定量、超敏C反应蛋白等,同时记录健康体检者相关资料。利用ELISA法检测DN组和对照组外周血IL-10水平,采用实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,qPCR)法检测两组外周血IL-10 RNA表达水平,使用血液基因组DNA提取试剂盒对两组进行DNA提取,经亚硫酸氢钠处理后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。运用统计学软件进行分析,探讨T2DM合并DN患者外周血IL-10的表达水平及与DNA甲基化的关系。结果1.一般资料及生化资料对比:DN组的收缩压、血尿素、血肌酐、空腹血糖水平均高于对照组,且有显著差异(P0.01)。DN组糖化血红蛋白水平比对照组明显升高,具有统计学意义(P0.05)。DNⅢ期患者的血尿素、血肌酐、24小时尿蛋白定量明显低于DNⅣ期患者,有显著差异(P0.01)。DNⅢ期患者的糖化血红蛋白、肾小球滤过率明显高于DNⅣ期患者,有统计学意义(P0.05)。DNⅢ期患者的收缩压明显低于DNⅣ期患者,有统计学意义(P0.05)。2.ELISA检测结果:DN组IL-10表达水平明显低于对照组(P0.01)。3.qPCR检测结果:与对照组相比,DN组的IL-10RNA表达水平明显降低,且存在显著性差异(P0.01)。其中,DNⅣ期患者的IL-10RNA水平较DNⅢ期患者升高,有统计学意义(P=0.014);与对照组相比,DNⅢ期与DNⅣ期患者IL-10RNA的表达水平均明显降低,且存在显著性差异(P0.01)。4.DNA甲基化测序结果:DN组启动子区有稍高水平的DNA甲基化,但与对照组相比没有明显差异。结论T2DM合并DN患者的外周血IL-10蛋白水平及IL-10RNA水平均明显下降,其启动子区有稍高水平的DNA甲基化,可能在DN病程的进展中发挥作用。
【图文】：

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图 1 ELISA 法检测 IL-10 建立的标准曲线见，本实验中 IL-10 ELISA 检测的方程为：y=253.31x-4.81984，该标准曲线可信度高。CR 检测 IL-10RNA 水平法的优化β-actin 荧光定量引物的设计与合成enbank 中人 IL-10,β-actin 的基因序列信息，，使用 Primer 5.0 简称 P1,P2,P3）。由北京六合华大基因科技有限公司合成。IL 扩增引物信息见表 3。表 3 IL-10 的荧光定量 PCR 扩增引物引物序列（5'-3'）退火温度（℃） GC 含量（%GAACCAAGACCCAGACATCACATTCTTCACCTGCTCCAC58.4259.764757GTGATGCCCCAAGCTGCGGCCTTGCTCTTGTTTT62.0055.406350

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图 2 引物 P1,P2,P3 标准曲线A,B,C 分别为 P1,P2,P3 的标准曲线通过图2 可以看出，P1 的相关系数为 0.9767，斜率为-2.4746；P2 的相关系数为 0.7822，斜率为-1.9023；P3 的相关系数为 0.9996，斜率为-3.2722。在 P3 扩增体系下可以得到最优的标准曲线，使起始模板浓度与循环数有良好的线性关系。② 扩增曲线、熔解曲线（见图 3）图 3 扩增曲线和熔解曲线A：cDNA 模板在 100,101,102,103稀释倍数下，引物为 P3 时获得的扩增曲线；B：引物为 P3 时获得的熔解曲线。通过图 3 可以看出，P3 的扩增曲线符合标准的“S”形荧光扩增曲线
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】