体外实验研究rno-miR-433-3p在高糖刺激下对肾纤维化的影响

发布时间：2020-06-03 21:26

【摘要】：[研究目的]既往研究表明在梗阻性肾病(UUO)中,miR-433是TGF-β/smad3诱导肾纤维化的重要调节者。miR-433启动子通过与smad3结合来放大TGF-β/smad3信号通路诱导的肾纤维化效应,同时发现下调miR-433的表达可显著减轻UUO肾纤维化。肾纤维化是糖尿病肾病的病理学特点之一,基于既往研究结果,本研究通过体外细胞实验研究证实rno-miR-433-3p在高糖刺激条件下对肾纤维化是否有影响。[对象和方法]一、qRT-PCR方法检测rno-miR-433-3p在不同浓度高糖和高糖不同时间刺激条件下的大鼠肾小管上皮细胞(Tubular epithelial cells,TECs)表达变化规律,寻找最佳高糖刺激时间和刺激浓度;qRT-PCR方法检测高糖刺激下TECs和肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,MMCs)中的肾脏纤维化指标(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SMA)表达变化规律。二、通过体外实验分别转染rno-miR-433-3p过表达和rno-miR-433-3p小发卡RNA rno-miR-433-3psmall hairpin RNA,rno-miR-433-3pshRNA)质粒至大鼠 MMCs和TECs中,qRT-PCR方法检测高糖刺激下MMCs和TECs中rno-miR-433-3p表达水平和肾脏纤维化指标(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SMA);Western blot方法检测高糖刺激下MMCs和TECs中肾脏纤维化指标(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SM A)表达情况。[研究结果]一、qRT-PCR检测结果显示,miR-433在高糖刺激的大鼠TECs中表达显著升高(p0.01)。高糖刺激TEC表达rbno-miR-433-3p,以浓度25mM和时间48小时为明显。高糖刺激的大鼠MMCs和TECs中Col-1,Col-4,FN,α-SMA表达显著升高(p0.01)。二、qRT-PCR检测结果显示,mo-miR-433-3p在体外转染mo-miR-433-3p过表达质粒的大鼠MMCs和TECs中表达显著增加(p0.01);mo-miR-433-3p在体外转染rno-miR-433-3pshRNA质粒的MMCs和TECs中表达显著降低(P0.01)。Col-1,Col-4,FN,α-SMA在转染rno-miR-433-3p过表达质粒的大鼠MMCs和TECs中表达显著增加(P0.01);而其在转染rno-miR-433-3pshRNA质粒的MMCs和TECs中表达显著降低(p0.01)。三、Western Blot 检测结果显示,Co1,Col-1,FN,α-SMA 在转染 mo-miR-433-3p过表达质粒的大鼠MMCs和TECs中表达显著增加,而其在转染rno-miR-433-3pshRNA质粒的MMCs和TECs中表达显著降低。[结论]一、大鼠MMCs和TECs在不同时间和不同剂量高糖刺激下mo-miR-433-3p表达和肾纤维化指标(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SMA)均明显升高,并表现出剂量和浓度依赖。高糖可能通过诱导MMCs和TECs中rno-miR-433-3p表达参与了高糖刺激诱发肾纤维化的发病机制。二、mo-miR-433-3p 过表达质粒和 rno-miR-433-3pshRNA 质粒对于大鼠 MMCs和TECs具有较高的转染效率,能够过表达或抑制细胞表达rno-miR-433-3p。rno-miR-433-3p是高糖刺激诱发肾纤维化的重要调节因子。上调rno-miR-433-3p的表达可增强高糖诱导的肾纤维化,下调rno-miR-433-3p的表达可抑制高糖诱导的肾纤维化。
【图文】：

ｒｏｕｃｔｒｏｍｒｅａｃｔｏｎ．ｕＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ邋ＰＣＲ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋ＩＩ逦１０邋ｕｌ逡逑ｄｄＨ２０逦７．６７ｕｌ逡逑总体积逦２０邋ｕｌ（３）充分混匀上述反应液，添加至ＰＣＲ管中，短暂离心以混匀试剂。逡逑（４）逦ＰＣＲ反应循环条件：９５°Ｃ邋１５ｓ，然后６０°Ｃ邋ｌｍｉｎ，６０°Ｃ邋ｌｍｉｎ，扩增共４循环。逡逑（５）循环结束后进行扩增曲线分析，实验重复３次。逡逑采用２＿ＡＡｃｔ相对定量法计算数据：求出每个样本的Ｃｔ值，以Ｕ６ｓｎＲＮＡ为对照，计算目的基因ｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ的相对表达量。逡逑ＡＣｔ＝Ｃｔｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ－Ｃｔ邋内参逡逑△邋ＡＣｔ＝ＡＣｔ高糖组－ＡＣｔ对照组逡逑２－ＡＡｃｔ＝高糖组较对照组的相对表达倍数逡逑Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｐｌｏｔ逡逑１０逡逑

昆明医科大学硕士研宄生学位论文邋Ｂｌｏｔ邋法检测邋ＮＲＫ５２Ｅ邋细胞中邋ｒｎｏ－ｍｉＲＮＡ－４３３－３ｐ邋过Ａ－４３３－３ｐ低表达的纤维化指标表达变化逡逑ｍＢｌｏｔ法检测结果所示：高糖刺激下，在经上调ｍｏ－ｍｉＲ－４３３Ｅ中，纤维化指标Ｃｏｌ－Ｉ、ＦＮ、ａ－ＳＭＡ蛋白表达水平显著升ｉＲ－４３３－３ｐ表达的ＮＲＫ５２Ｅ中，纤维化指标Ｃｏｌ－Ｉ、ＦＮ、ｃｔ－Ｓ著降低（见图７）。逡逑果提示：体外上调ｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ或下调ｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ，刺激肾小管上皮细胞纤维化。逡逑＿
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】

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本文编号：2695424