GGNBP2调控小鼠精母细胞DNA双链断裂修复和组蛋白泛素化修饰的机制研究

发布时间：2020-06-07 06:18

【摘要】：精子发生是一个极其复杂的细胞分化过程,主要包括精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段。在这一复杂的过程中,涉及了多种基因调控和蛋白表达修饰变化,除了可以在转录水平研究基因表达的蛋白功能外,在蛋白水平研究蛋白质的翻译后修饰也具有重要意义。组蛋白翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等。这些翻译后修饰在染色质的结构重塑、基因的转录调控、DNA的损伤修复等生命过程中发挥着极其重要的作用。配子生成素结合蛋白2(Gametogenetin binding protein 2,GGNBP2),又称锌指蛋白403,是配子生成素(GGN)的结合蛋白,在睾丸组织中高表达,酵母双杂交实验证实GGNBP2能够与GGN1、GGNBP1以及OAZ3相互作用,在精子发生过程中起决定作用。我们前期工作发现Ggnbp2基因敲除引起雄性小鼠无精子症,生精过程阻滞于精子细胞,生精上皮管腔完整性破坏,精子顶体、核仁畸形。本课题拟在此基础上,体内外实验进一步研究GGNBP2和GGN1(GGN蛋白最大异构体)在精母细胞减数分裂,DNA双链断裂修复中作用,以及GGNBP2在调控组蛋白翻译后修饰的分子机制。研究结果如下:(1)相互免疫共沉淀证实GGNBP2与GGN1互作,两种蛋白共同定位于小鼠精母细胞和精子细胞(Golgi phase,Cap phase)细胞核和胞浆,精子细胞(Acrosome phase,Maturation phases)顶体和尾部,GGNBP2缺失引起幼龄和成年小鼠睾丸组织GgnmRNA水平和蛋白水平减低,免疫荧光显示GGN1表达更加局限于细胞核,胞浆染色荧光强度显著减弱。流式细胞术和RT-PCR显示基因敲除组睾丸生殖细胞单倍体细胞数量减少,而四倍体细胞数量增加。(2)成功构建Ggnbp2和Ggn基因敲除的体外精母细胞(GC-2spd),XTT和流式细胞术显示Ggnbp2和Ggn基因敲除在32℃条件下能抑制GC-2spd细胞增殖和分化,37℃条件下对细胞增殖无影响,但仍能抑制精母细胞分化为单倍体细胞。Ggnbp2基因敲除降低Ggn mRNA和蛋白表达。过表达Ggnbp2能恢复Ggnbp2KO细胞Ggn基因和蛋白的水平,也能部分恢复分化功能,而对GgnKO细胞的分化功能无影响。(3)免疫共沉淀显示GGNBP2能与DNA修复蛋白FANCL、RAD51、RAD18相互作用。Ggnbp2基因敲除不影响联会复合体(SYCP3/SYCP1)染色改变,而粗线期和双线期精母细胞g-H2AX弥散分布于所有染色体,而不局限于XY小体上;RAD51在XY小体染色无明显差异,而常染色体染色荧光点显著增加;RAD18除XY小体外,其他部位均可见点状表达,而BRCC36 foci显著增加。(4)体内外实验均显示Ggnbp2基因敲除上调组蛋白H2A_(K119)泛素化水平。免疫共沉淀实验显示GGNBP2与多梳蛋白家族成员ASXL1作用,而不与去泛素化酶BAP1相互作用,该蛋白缺失影响ASXL1与BAP1相互作用,而不影响其蛋白表达。同时Ggnbp2基因敲除对ASXL1的染色定位无影响,但能改变BAP1定位,引起BAP1聚集于胞浆,在细胞核内不表达。(5)体内外实验均显示Ggnbp2基因敲除下调组蛋白H2B_(K120)泛素化水平。免疫共沉淀实验,结果提示GGNBP2与泛素结合酶E2 B(UBE2B)相互作用,而不与泛素连接酶E3 RNF40相互作用。GGNBP2蛋白缺失能阻断UBE2B与RNF40相互作用,同时上调UBE2B表达,而不影响RNF40蛋白表达。(6)GGNBP2蛋白不与泛素特异性蛋白酶超家族(USP)相互作用,但Ggnbp2基因敲除下调特异性H2A_(K119)去泛素化酶下调特异性H2A_(K119)去泛素化酶USP16、USP21和非特异性去泛素化酶USP3、USP22表达,而不影响H2B_(K120)去泛素化酶UBP10、USP7表达。本研究得出以下结论:1.GGNBP2作为GGN结合蛋白,与GGN共同定位于精母细胞胞核和胞浆以及精子细胞的顶体和尾部,在小鼠精子细胞分化以及精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。2.Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷可能与GGN1参与的减数分裂过程中DNA双链损伤修复机制受损有关。3.组蛋白泛素化修饰在DNA双链损伤修复机制中发挥重要作用。GGNBP2可能通过调控去泛素化酶复合体ASXL1/BAP1结合,或者泛素特异性蛋白酶USP表达影响组蛋白H2A_(K119)去泛素化。同时GGNBP2通过影响泛素结合酶E2B和泛素连接酶RNF40相互作用,调控组蛋白H2B_(K120)泛素化水平。
【图文】：

图 1.2.3 组蛋白结构图。负责组蛋白 H2A，H2B 泛素化和去泛素化酶（H3、H4 甲基化、乙酰化位点已标出）组蛋白 H2A 赖氨酸 119 位点泛素化于 1977 年首次被发现[40]。它由一些多梳抑制复合体 1（Polycomb repressive complex 1,PRC1）催化亚基蓄积[41]。多梳蛋白抑制复合体（PRC1/PRC2）一直被认为是发育和基因转录抑制的调控因子，由多种不同亚基构成，表现为不同的酶活性[42]。PRC1 可以泛素化 H2A 赖氨酸 119 位点[41]。PRC2 催化 H3 赖氨酸 27位点三甲基化[43]。多梳蛋白其生物学功能作用广泛，已被证实主要其亚基组成发挥重要功能[42]。PRC1 和 PRC2 的募集是一个逐级渐进的过程。基于 PRC1 复合体通过其 CBX 蛋白识别 H3K27me3，，推测 PRC2 甲基化目标染色质，从而使 PRC1 募集并催化 H2AK119位点泛素化，导致基因沉默[44-46]。而最近研究发现 PRC2 募集依赖于 PRC1 活性[47, 48]。H2AK119位点泛素化对 PRC2 募集至关重要，PRC1 通过其 KDM2B 亚基依附于非甲基化 CpG 岛，改变募

第 1 章 绪论生过程有丝分裂时期, 在组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferase, HAT)催化下, 组蛋白 H3、 H4 能够呈高度乙酰化状态[91]，乙酰基与组蛋白 H4 上的赖氨酸残基结合, 并中和其所带正电荷，导致染色质结构松散，同时易于与转录因子等转录相关蛋白结合[92]，协同组蛋白甲基化改变，共同促进基因的转录。而在减数分裂时期，在组蛋白去乙酰化酶(Histondeacetylase, HDAC)作用下，组蛋白 H3、 H4 呈现低乙酰化状态[93, 94]。精子形成时期，组蛋白 H4 重新被乙酰化，使核小体形成一个比较宽松的结构，易于精蛋白替代组蛋白[95, 96]，高乙酰化 H4 出现于早期的长形精子细胞，从整体上影响着细胞核的结构，而这种影响会随着精子细胞的拉伸和压缩期而发生改变，最后随着核高度压缩的精子向附睾迁移。1.2.9 组蛋白的甲基化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R698.2

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本文编号：2700986