转录因子LMO4调控前列腺癌细胞增殖及其机制的初步研究

发布时间：2020-06-10 11:09

【摘要】：研究背景和目的前列腺癌是男性最常见的肿瘤之一,在西方国家的发病率普遍较高。我国男性发病率虽然低于西方国家,但近年来呈逐年上升趋势,前列腺癌晚期患者数较多,死亡率较高。目前雄激素剥夺治疗法是前列腺癌的主要治疗方法,许多前列腺癌患者在接受雄激素剥夺治疗后,不可避免的由雄激素依赖性前列腺癌发展成雄激素不依赖性前列腺癌,前列腺癌细胞的增殖能力增强,对化疗和放疗的抵抗能力增强,这为肿瘤的治疗带来困难。肿瘤干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的恶性肿瘤细胞,它维持肿瘤细胞增殖,并分化出具有不同功能的肿瘤细胞。研究表明在前列腺癌组织中存在前列腺癌干细胞,但是前列腺癌干细胞的来源及其标记分子仍不清楚。CD133最早在造血干细胞和神经干细胞中发现,是造血和神经干细胞的重要标记分子。在多种肿瘤中,例如黑色素瘤、神经胶质瘤等将CD133作为肿瘤干细胞标记分子。有文献报道在前列腺癌细胞中,CD133~+前列腺癌细胞表现出较强的克隆形成能力、抵抗药物的能力和抵抗射线的能力,但CD133是否可以作为前列腺癌干细胞的标记分子仍存在很大争议。LMO4属于LMO家族成员,是重要的核转录因子。LMO4在在胚胎的发育过程中发挥重要作用,包括神经,皮肤,耳蜗的发育。有研究表明lmo4-/-小鼠在围产期致死率较高,并且神经管闭合不全。在成人的不同组织中LMO4的表达量也有差异,在胃、小肠、肾组织中表达量较高,而前列腺、精囊等组织中表达量较低。许多恶性肿瘤的发生和发展与LMO4的异常表达有关,在乳腺癌细胞系中过量表达LMO4,细胞的迁移和侵袭能力增强。对乳腺癌患者的病理组织研究发现,LMO4在乳腺癌组织中的mRNA和蛋白水平均提高,并且LMO4表达量较高的患者预后较差。在造血细胞增殖与分化的研究过程中发现LIM结构域结合蛋白LDB-1和LMO家族蛋白LMO2、LMO4、周期蛋白依赖性激酶CDK9等共同组成一个大复合体调控细胞的细胞增殖过程。当细胞被诱导分化、增殖停止时,ETO-2等蛋白新的复合体从大复合体中脱落,大复合体变为两个小复合体,CDK9从LDB1上脱落,LMO4蛋白水平上升结合在LDB-1等蛋白构成的核心复合体中,在终末分化之后开始基因的转录。LMO4的异常表达与多种肿瘤的发生发展有关,但与前列腺癌之间的研究较少,LMO4是否参与调控前列腺癌发生发展过程仍不清楚;与CD133~-前列腺细癌细胞相比,前列腺癌CD133~+细胞对放化疗有很强的抵抗能力,较强的增殖能力。LMO4是否影响CD133的表达和前列腺癌CD133阳性细胞数,是否影响前列腺癌细胞的增殖能力有待探究。本研究可能为前列腺癌的治疗方法提供新思路。研究方法在组织学水平研究中,利用前列腺癌组织和正常前列腺组织的切片,HE染色观察前列腺癌组织结构特征;免疫组织化学法检测LMO4与CD133的表达,探究LMO4和CD133在前列腺癌组织中的表达水平以及是否具有表达一致性。在细胞水平的研究用人前列腺癌细胞系PC-3作为研究对象,利用流式分选技术从PC-3细胞中分选出CD133~+细胞PC-3/CD133~+和CD133~-细胞PC-3/CD133~-,软琼脂克隆形成实验检测PC-3/CD133~+的克隆形成能力,qPCR检测干细胞标记分子CD44、OCT-4和SOX2的mRNA水平。在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4获得PC-3/SiLmo4细胞株,Western blot检测LMO4和CD133的蛋白表达水平,免疫荧光实验和流式细胞术检测前列腺癌CD133~+细胞数的变化。通过EDU细胞增殖实验检测人前列腺癌细胞的增殖速率。免疫共沉淀法检测LMO4与CDK9在前列腺癌细胞中的相互作用和动态变化。研究结果(1)HE染色证实了前列腺癌组织标本符合前列腺癌组织特征,表现为前列腺癌组织内腺体形状大小改变,失去腺体结构。癌细胞浸润周围基质,腺体相互融合,可见不规则浸润性肿块或恶性上皮细胞构成的索和链(2)免疫组织化学染色表明,与前列腺增生组织相比,在前列腺癌组织中LMO4和CD133的表达水平较高。1在前列腺癌组织中腺体结构消失,恶性上皮细胞细胞膜表面可见CD133高表达。在10例前列腺癌组织切片中有8例CD133的表达量增高,而7例前列腺增生组织中腺体结构完整,CD133的表达均为阴性。(2)前列腺癌组织部位LMO4的表达显著增高。恶性上皮细胞细胞核内可见LMO4表达上升;在前列腺增生组织中,LMO4的表达量整体较低,部分上皮细胞核内可见LMO4表达。在10例前列腺癌组织切片中有8例LMO4表达量升高,而7例前列腺增生组织中仅有2例LMO4表达量升高,在7例前列腺癌组织切片中LMO4与CD133均成阳性,LMO4与前列腺癌干性标记分子CD133的表达具有一致性。(2)Western blot结果显示,在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后,CD133的表达量降低,LMO4与CD133的表达具有一致性。干涉Lmo4后使前列腺癌细胞的CD133表达水平降低。(3)免疫荧光实验显示,在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后,CD133的荧光强度降低,CD133~+细胞数减少。(4)流式细胞术结果表明,在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后,利用带荧光标记的Alexa Fluor 647~(TM)标记CD133分子,流式细胞分析技术显示CD133阳性细胞数减少,提示LMO4影响前列腺癌CD133~+细胞数量。(5)在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后,前列腺癌细胞PC-3的增殖能力降低。通过EDU细胞掺入实验显示,在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后,EDU的掺入量减少,经荧光标记后显示阳性细胞减少。提示LMO4与前列腺癌细胞的增殖有关,在人前列腺癌细胞系PC-3中降低LMO4的表达,细胞的增殖减慢。(6)克隆形成实验表明,在人前列腺癌细胞系PC-3中CD133~-细胞克隆形成数低于CD133~+细胞克隆形成数。利用流式分选技术分选出CD133~+和CD133~-细胞,将相同数目的细胞接种于软琼脂培养基中,CD133~+细胞的克隆形成率为12.5%显著高于CD133~-细胞的克隆形成率5.75%。与PC-3/CD133~-细胞相比PC-3/CD133~+细胞具有更强的克隆形成能力。在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后,克隆形成率由24.00%降至7.10%。在人前列腺癌细胞系PC-3中干涉Lmo4后克隆形成能能力降低。(7)免疫共沉淀方法证实正常前列腺细胞中LMO4与CDK9形成复合体,过量表达LMO4后使二者结合减少;而在前列腺癌细胞中未见LMO4/CDK9复合体的形成。研究结论(1)在前列腺癌组织和细胞中LMO4与CD133的表达具有一致性,LMO4可能调控CD133的表达水平和CD133~+细胞数。(2)LMO4调控前列腺癌细胞的增殖有关。(3)前列腺癌细胞中LMO4调控细胞的增殖不依赖于LMO4/CDK9的复合体。
【图文】：

载体,图谱,慢病毒,安徽医科大学

2.1.3 实验用生物材料（1）组织标本本实验所使用的前列腺癌和前列腺增生组织切片由安徽医科大学第一附院病理科提供。（2）细胞系人前列腺癌细胞系PC-3和人正常前列腺细胞系PET2-TGC。人前列腺癌细由安徽医科大学第一附属医院张力博士惠赠，人前列腺细胞系由上海中医药柯细松教授惠赠。（3）载体干涉 LMO4 所使用的慢病毒载体 GV248，，过表达 LMO4 所使用的慢病毒GV287，人慢病毒干涉质粒 shRNAb-Lmo4 和 shRNAc-Lmo4 均购自上海吉凯公司（Figure 2），人过表达 LMO4 慢病毒购自上海吉凯基因公司。

前列腺癌,苏木精-伊红染色,前列腺增生,组织切片

安徽医科大学硕士学位论文3. 实验结果3.1 组织学水平研究证实核转录因子LMO4在前列腺组织中高表达3.1.1 苏木精-伊红染色观察前列腺癌组织结构变化对前列腺癌组织和前列腺增生组织进行H&E染色。结果显示与正常前列腺组织相比，前列腺癌组织内腺体与腺体距离减小，腺体的形状大小改变，失去腺体结构。癌细胞浸润周围基质，腺体相互融合，可见不规则浸润性肿块或恶性上皮细胞构成的索和链（Figure 1）。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.25

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