骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2020-06-20 09:14

【摘要】：目的:睾丸扭转作为泌尿外科急症之一,扭转后的复位引发的相关损伤是典型睾丸缺血再灌注损伤,对睾丸的生理结构和生精功能损害甚大,甚者可能导致不育。本研究探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤保护作用,为探讨睾丸扭转治疗提供新方向。方法:从3-4周龄大鼠的骨髓中采用原代培养方法分离出骨髓间充质干细胞(BMSCs),培养并鉴定大鼠BMSCs。通过观察原代培养出来细胞贴壁的不同时间段的细胞生长形态,用流式细胞仪器检测原代培养细胞的表面特有蛋白标记物,并对其进行向成骨细胞和成脂肪细胞分化的诱导来证实我们已成功地分离和培养骨髓间充质干细胞。以去外泌体血清大量培养并收集细胞上清,对收集细胞上清采用超速离心的方法提取BMSCs来源的外泌体,并对所提物质采用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)分析其大小,透射电子显微镜观察(TEM)其形态以及蛋白免疫印迹法检测其典型标志蛋白质来鉴定提取确为外泌体。构建雄性SD大鼠睾丸缺血再灌注损伤(IRI)模型,24只健康青春期雄性SD大鼠随机分为三组;A:假手术组(Sham组),缺血再灌注组(I/R组)分为两组:B组:生理盐水处理组(I/R+NS),C 组:BMSCs 来源外泌体(100ug/ml)处理组(I/R+BMSCs-exo)。最后取各组大鼠扭转侧(左侧)睾丸,采用共聚焦观察外泌体在睾丸内的分布,光学显微镜检测各组睾丸组织病理学结构改变并对其进行HE组织结构的评分以及精原细胞对外泌体的摄取情况,采用生物化学的方法检测各组睾丸组织中Superoxide Dismutase(SOD,超氧化物歧化酶),Malondialdehyde(MDA,丙二醛),Nitric Oxide Synthesis(NOS 一氧化氮合成酶),Total antioxidant capacity(T-AOC,总抗氧化能力)和Catalase(CAT,过氧化氢酶)的含量。同时采用蛋白免疫印迹法检测各组睾丸组织中高迁移率族蛋B1(HMGB1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白3(Caspases-3),Bax及B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)蛋白表达水平。结果:成功地从大鼠骨髓中分离和培养BMSCs,并成功提取了 BMSCs分泌的外泌体。在缺血再灌注损伤动物模型中,A组(Sham)睾丸形态正常,结构层次分明,生殖细胞排列整齐有序,有正常的生精小管和生精细胞。与假手术组对比,B组(I/R+NS)睾丸组织损伤最显著,表现为管腔内可见大量渗出,空泡形成。生精细胞排列紊乱,细胞层次不清,生精上皮或一定程度缺失或脱落。而在C组(I/R+BMSCs-exo)治疗组中,睾丸结构虽紊乱但有一定层次,生殖细胞排列紧密,生精细胞空泡形成和杂乱无章的上皮细胞有一定程度的减少且在HE组织结构评分上有明显的统计学意义(p0.05)。镜下观察到精原细胞能摄取外泌体,且外泌体能透过血睾屏障达到睾丸里面。睾丸组织生化指标检测中,B 组(I/R+NS)组织中的 MDA 和 NOS(tNOS and iNOS)的含量较 A 组(Sham)升高且具有统计学意义(p0.01),而SOD,T-AOC和CAT的含量与A组(Sham)相比则有统计学上降低(p0.01)。而在经外泌体处理之后的C组(I/R+BMSCs-exo)中,与生理盐水处理组B组(I/R+NS)相比较,组织中MDA和NOS(tNOS and iNOS)的含量有一定意义的降低(p0.05),且SOD,T-AOC和CAT的水平有统计学意义升高(p0.5)。蛋白免疫印迹检测睾丸组织相关蛋白表达中,与 A 组(Sham)相比,Caspases-3,Bax,HMGB1 在 B 组(I/R+NS)的表达水平显著升高(***p0.001),BCL-2的表达水平则下降(p0.05),C组(I/R+BMSCs-exo)中,Caspases-3,Bax,HMGB1 表达水平有一定程度的降低(p0.01)以及BCL-2一定程度表达水平的升高(p0.05)。结论:骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤有抗氧化,减少炎症与凋亡的保护作用。为后续临床上对睾丸扭转复位后及其相关并发症治疗提供新的方向和研究基础。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R697.22
【图文】：

逑求其平均值，连续计数一周（７天）。以时间为纵坐标，细胞个数为横坐标绘制逡逑生长曲线图（如图２所示）。逡逑２．３骨髓间充质干细胞的鉴定逡逑⑴处理细胞：取Ｐ３邋ＢＭＳＣｓ进行消化及细胞计数板计数，每管１００＾１分别入７逡逑个ＥＰ管，约２ｘｌ0６个细胞；设ＣＤ３４及其同型对照管、ＣＤ４４及其同型对照管、逡逑ＣＤ４５和ＣＤ９０及其同型对照管；逡逑（２）

逦第一部分大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）原代、传代培养及鉴定逦逡逑２．骨髓间充质干细胞的诱导分化逡逑（１）成脂肪细胞的诱导：ＭＳＣｓ经成脂肪诱导液培养２１ｄ后，经Ｏｉｌ邋Ｒｅｄ邋０（油逡逑红０）染色，在漩涡状紧密排列的细胞集落中央可观察到散在的充满脂滴的脂防逡逑细胞形成。阳性显示脂滴为红色（图３Ｃ），对照组染色为阴性（图３Ａ）逡逑（２）成骨细胞的诱导：ＭＳＣｓ经成骨诱导液培养２１ｄ后，细胞形态由梭形变为逡逑多角形，细胞呈多层性重叠性排列，间质内含大量矿盐沉积的钙化结节。茜素逡逑红染色阳性呈棕色，对照组染色为阴性（图３Ｂ）。（如下图所示）逡逑

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：2722206