特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质组学以及基因组学研究

发布时间：2020-06-21 08:32

【摘要】：研究背景据调查全世界大约8%的育龄男性存在生育障碍,男性不育患者至少达到2000万。男性不育的病因是多方面的,已知的原因包括:先天性或获得性泌尿生殖系统异常,恶性肿瘤,泌尿生殖道感染,阴囊温度升高,内分泌紊乱,免疫因素和一些特征性的遗传异常。但仍有大约40%的男性不育患者的病因尚不明确。尽管辅助生殖技术为不孕不育患者带来了福音,但大约有一半的夫妇即使经过多次治疗仍未能成功怀孕。因此研究不育症的分子机制将有助于将来不育症的精确诊断和精准治疗。第一部分畸形精子的细胞力学研究目的:以特发性不育症家系患者的精子作为研究对象,用原子力显微镜研究精子头部的力学特征以及力学特征和染色质凝集的关系。方法:收集不育症家系病患的精液标本和正常生育能力的志愿者的精液标本。采用上游法分离精子。使用原子力显微镜观察单个无定型头畸形精子和单个正常精子的活体形貌,精子表面粗糙度,并表征单个精子的物理学特性。对比分析正常形态精子和头部畸形精子之间的形貌差异以及物理学特性的差异。分析精子物理学特性和染色质凝集之间的关系。采用苯胺蓝染色、精子染色质结构试验(sperm chromatin structure assay,SCSA)、免疫印迹法以及透射电镜来检测精子染色质凝集状态。结果:发现头部畸形精子的表面形貌,物理学特性,染色质凝集状态与正常形态精子显著不同。头部畸形精子的长、宽、高均大于正常精子。顶体后区长度也大于正常精子。头部畸形精子的表面粗糙度大于正常精子(343.21±94.71 nm vs.232.10±49.65 nm(P0.0001),刚度小于正常精子(3.54±0.52 vs.4.25±1.39;P0.001)。苯胺蓝染色和免疫印迹法结果均提示畸形精子的组蛋白没有完全被鱼精蛋白替换。SCSA结果显示与正常精子相比畸形精子呈现高DNA可染率(high DNA stainability,HDS)(26.95±2.75%vs.9.40±2.87%;P0.001),和高精子DNA碎片率(DNA fragmentation index,DFI)(45.69±2.15%vs.8.02±2.57%;P0.001)。透射电镜超微结构观察显示精子染色质结构松散。Pearson检验发现精子核区刚度和染色质凝集程度呈正相关。结论:精子的物理学特征可以作为评价精子质量的新指标。本研究首次采用物理学方法来研究精子,为进一步了解畸形精子症做出了贡献。第二部分特发性男性不育症家系的蛋白组学研究目的:以不育症家系病患的精子和正常精子为研究对象,通过双向电泳和MALDI-TOF-MS技术研究病患精子和正常精子的差异蛋白图谱,探讨畸精不育的分子机制。方法:收集不育症家系病患的精液标本和40例生育力正常的志愿者的精液标本。采用密度梯度离心分离精子,尿素/硫脲法提取精子蛋白。2-DE分离差异蛋白,银染后用PDQuest8.0软件分析比较病患精子和正常精子的电泳图谱,寻找差异蛋白点。对差异蛋白点行MALDI-TOF-MS分析,将获得的肽质量指纹谱(PMF)进行数据库搜索和生物信息学分析。利用DAVID软件对差异蛋白行功能聚类分析,利用STRING软件预测差异蛋白间相互作用。结果:本实验获得清晰且重复性好的异常精子组和正常精子组的双向凝胶电泳图谱。两组的2-DE图谱中有26个点发生明显变化,其中12个上调,14个下调。将26个蛋白点进行质谱鉴定成功鉴定了26个蛋白。其中在特发性男性不育症家系患者中表达上调的蛋白质:Semenogelin-1、Semenogelin-2、SEMG2 protein。其中表达下调的蛋白质:ropporin-1A isoform a、clusterin preproprotein、ASRGL1protein、Glutathione S-transferase Mu 3、Tubulin alpha-3E chain、Tubulin beta-4B chain、Succinate--CoA ligase[ADP-forming]subunit beta,mitochondrial、Sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome C、SPANX-C。功能富集分析显示,这些差异蛋白主要涉及结合、催化、分子结构这三种分子功能。结论:差异表达蛋白Semenogelin-1 preproprotein,Semenogelin-2preproprotein,SEMG2;GSTMu3可能与家系患者精子的运动能力低下有关。差异表达蛋白TUBB4B,TUBA3E,Ropporin,SPANX-C可能与家系患者精子畸形有关。差异表达蛋白CLU,HYOU1,SUCLA2可能与家系患者精子数量减少有关。第三部分特发性男性不育家系的基因组学研究目的:以特发性男性不育家系患者为研究对象。筛选并鉴定导致不育的致病基因,为临床上不育症患者的基因诊断和遗传咨询提供理论依据。方法:研究对象是两个不育症兄弟。首先,以其父母是近亲婚配为切入点,采用全外显子组重测序方法,对获得的数据按单基因病模式进行生物信息学分析,重点关注可能致病的纯合突变。然后,对家系内所有成员行Sanger测序验证全外显子组测序的结果,并在家系内进行表型与基因型共分离分析。再用计算机结构建模来预测突变导致的功能后果。最后,用Fasttarget二代测序验证候选致病突变在124例散发病患和200例具有生育力的健康人群中的突变情况。结果:在近亲婚配家系中发现一个新的纯合错义突变FBXO43(c.1991CT/p.Gly664Asp)。在该家系基因突变与表型共分离,并且该基因突变被SIFT,PolyPhen-2和Mutation Taster预测为突变蛋白具有致病性。计算机结构建模预测突变p.Gly664Asp导致FBXO43蛋白增加了一个α-螺旋并缩短两个β-折叠,这可能是导致功能异常的原因。在124例散发不育症患者中对FBXO43进行突变筛查,鉴定出另外4个具有杂合FBXO43突变的病例。并且在200例正常对照中,未发现FBXO43突变。结论:FBXO43突变可能是导致不育症家系患病的原因。FBXO43突变可能与男性不育症和畸形精子症有关。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R698.2
【图文】：

1 精子鞭毛超微结构模式图（引自 Csilla Krausz）。精子由两部分组成：头部和其中鞭毛分为４个节段，分别是颈段、中段、主段和末端；a.正常精子鞭毛。失动力蛋白臂。c. 鞭毛缺失放射幅鞭毛。d. 鞭毛缺失中央微管（9+0 结构）。1 The axoneme ultrastructure and its defects found in patients with multiple morphrmalities of the sperm flagella and primary ciliary dyskinesia. (a) Normal sperm axxoneme lacking dynein arms. (c) Axoneme without radial spokes. (d) Absence of thpair of microtubules of the axoneme (structure 9 + 0).弱精子症的蛋白质组学分析显示鞭毛不同组分的表达减少。有六项关的差异蛋白质组学研究中[20-25]，其中有三个 ODF2 表达下降[23-25]。O除小鼠表现为精子尾部缺陷，包括缺少 个或多个微管，尾部弯曲，子活力下降[26]。TEKTs（TEKT1，TEKT4 和 TEKT5）也在弱精子症下调[20,23,24]。 TEKTs 蛋白定位于鞭毛中的微管、基体和中心粒。目人类的五种 TEKTs（TEKT1，TEKT2，TEKT3,TEKT4 和 TEKT5）和精子中表达。他们定位于鞭毛，并且几乎都定位于线粒体鞘、外周纤维鞘[27]。TEKT3 和 TEKT1 定位于精子的顶体区[28,29]。TUBB2B 是

图 1-2 巨头精子症相关基因示意图（引自 An Bracke）Fig1-2 Representation of the genes linked to Macrozoospermia圆头精子症也是 种非常罕见的疾病，不育男性的发病率不到 0.1%。它点是精子头部呈圆形，缺乏顶体，核膜异常和中段缺陷[49]。顶体缺乏是精生后期的生物学事件，精子头部呈圆形是其主要形态学特征[50]。无顶体精能通过透明带与卵母细胞融合，精子不能激活卵母细胞导致受精失败，即使

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本文编号：2723814