rhTNFR:Fc对高糖作用下大鼠肾小球内皮细胞坏死性凋亡途径的影响
发布时间：2020-06-25 00:59
【摘要】：目的:探讨重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor-alphareceptor II:Ig G Fc,rhTNFR:Fc)是否能够减轻高糖作用下大鼠肾小球内皮细胞(Rat glomerular endothelial cells,RGECs)坏死性凋亡的发生,进而减轻细胞死亡、炎症反应及损伤,并探讨其机制。方法:对RGECs进行体外培养,用凝血因子VIII鉴定为内皮细胞后,将其根据不同干预条件随机分为以下四组:正常组(5.5mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)、高糖组(30mmol/L葡萄糖)和高糖+150ng/ml rhTNFR:Fc组(30mmol/L葡萄糖+150ng/ml rhTNFR:Fc)。采用免疫细胞化学、免疫荧光检测各组TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的蛋白表达定量及定位;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的m RNA表达情况;采用蛋白印迹法(WB)检测各组TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的蛋白表达情况。结果:1.培养的大鼠肾小球细胞胞浆内可表达凝血因子VIII,鉴定为内皮细胞。2.免疫细胞化学:TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6主要在RGECs的胞浆中表达,高糖组的表达量明显多于正常组和甘露醇组(P值均0.01),而高糖+150ng/ml rhTNFR:Fc组的表达较高糖组明显减少(P0.01),而其余组之间上述指标的表达无差异(P0.05)。3.免疫荧光:TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6主要在RGECs的胞浆中表达,高糖组的荧光明显强于正常组和甘露醇组。而高糖+150ng/ml rhTNFR:Fc组的荧光明显弱于高糖组,其余组之间无明显亮度差异。4.RT-PCR:高糖组,TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的m RNA相对表达量明显多于正常组及甘露醇组(P值均0.01),而高糖+150ng/ml rhTNFR:Fc组的表达较高糖组明显减少(P0.01),其余组之间上述指标的表达无差异(P0.05)。5.WB:高糖组,TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的蛋白表达量明显多于正常组和甘露醇组(P值均0.01),而高糖+150ng/ml rhTNFR:Fc组的表达较高糖组明显减少(P0.01),其余组之间上述指标的表达无差异(P0.05)。结论:RGECs在高糖刺激下,发生坏死性凋亡明显增多,进而发生了较明显的炎症反应和损伤,而使用了rhTNFR:Fc干预后,TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的m RNA和蛋白表达均下调,说明rhTNFR:Fc可能通过抑制TNF-α在RGECs的表达,进而部分阻断坏死性凋亡途径,减轻了RGECs的炎症反应和损伤。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：
遵义医学院硕士学位论文 祝建Necroptosis 途径可以被肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活。TNF-α与细胞膜上的肿瘤死因子受体 1(TNFR-l)结合，激活细胞质里的受体相互作用蛋白 1(Receptorinteracprotein 1,RIP1)和受体相互作用蛋白 3(Receptorinteraction protein 3,RIP3)，RIP1和 R是受体相互作用蛋白(Receptorinteraction protein，RIP)的家族成员，两者 N 末端和末端有 RIP同源结构域(RIP homotypic interaction motif,RHIM)，可使两者相互结合［RIP1 和 RIP3 分别在受体相互作用蛋白激酶 1(Receptorinteraction protein kinn1,RIPK1)和受体相互作用蛋白激酶 3(Receptorinteraction protein kinnase 3,RIPK3)的用下磷酸化［16-17］。RIP1 和 RIP3 磷酸化且相互结合后发生结构改变形成 RIP1-R复合体，RIP1-RIP3 复合体招募并激活下游底物混合谱系激酶结构域样蛋白(Milineage kinase domain-like protein,MLKL)，MLKL 是坏死性凋亡通路中一个关键的游效应器，在 RIP3 诱导下发生磷酸化，最终形成坏死性凋亡［18］。如图 1 所示。
图 2 大鼠肾小球内皮细胞 RGECs（X100）定 RGECs：胞浆呈绿色，细胞核呈蓝色(DAPI 染色)，将于细胞的胞浆中，即证实为 RGECs，如图 3Factor VIII M图 3 Factor VIII 免疫荧光鉴定（X200）RGECs 的活性
本文编号：2728625
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：
遵义医学院硕士学位论文 祝建Necroptosis 途径可以被肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活。TNF-α与细胞膜上的肿瘤死因子受体 1(TNFR-l)结合，激活细胞质里的受体相互作用蛋白 1(Receptorinteracprotein 1,RIP1)和受体相互作用蛋白 3(Receptorinteraction protein 3,RIP3)，RIP1和 R是受体相互作用蛋白(Receptorinteraction protein，RIP)的家族成员，两者 N 末端和末端有 RIP同源结构域(RIP homotypic interaction motif,RHIM)，可使两者相互结合［RIP1 和 RIP3 分别在受体相互作用蛋白激酶 1(Receptorinteraction protein kinn1,RIPK1)和受体相互作用蛋白激酶 3(Receptorinteraction protein kinnase 3,RIPK3)的用下磷酸化［16-17］。RIP1 和 RIP3 磷酸化且相互结合后发生结构改变形成 RIP1-R复合体，RIP1-RIP3 复合体招募并激活下游底物混合谱系激酶结构域样蛋白(Milineage kinase domain-like protein,MLKL)，MLKL 是坏死性凋亡通路中一个关键的游效应器，在 RIP3 诱导下发生磷酸化，最终形成坏死性凋亡［18］。如图 1 所示。
图 2 大鼠肾小球内皮细胞 RGECs（X100）定 RGECs：胞浆呈绿色，细胞核呈蓝色(DAPI 染色)，将于细胞的胞浆中，即证实为 RGECs，如图 3Factor VIII M图 3 Factor VIII 免疫荧光鉴定（X200）RGECs 的活性
【参考文献】
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3 张莹;蛋白激酶C抑制剂对糖尿病肾病保护作用的研究[D];大连医科大学;2002年
本文编号：2728625
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