Pannexin1通道在睾丸癌细胞侵袭迁移中的作用及可能机制

发布时间：2020-06-27 05:46

【摘要】：目的:1.观察pannexin1通道蛋白在睾丸细胞中的表达。2.明确pannexin1通道对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的作用及可能机制。方法:1.Western blotting法检测睾丸间质细胞TM3和睾丸癌I-10细胞中pannexin1蛋白表达。2.Pannexin1通道抑制剂甘珀酸(CBX)和丙磺舒(PBN)作用睾丸癌I-10细胞后,使用实时荧光传递法和细胞外ATP检测法检测CBX和PBN对pannexin1通道功能的抑制作用;transwell法和细胞划痕法检测CBX和PBN对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的抑制作用;western blotting法检测侵袭迁移相关蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表达。3.分子生物学沉默(sh RNA)和过表达pannexin1(m Panx-1)后,使用实时荧光传递法和细胞外ATP检测法检测sh RNA和m Panx-1分别抑制和增强pannexin1通道功能;transwell法和细胞划痕法检测sh RNA对睾丸癌I-10细胞侵袭迁移的抑制作用和m Panx-1增强睾丸癌I-10侵袭迁移能力;western blotting法检测侵袭迁移相关蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表达。4.在sh RNA和m Panx-1稳转细胞株中,使用U0126(p-ERK抑制剂)抑制p-ERK的表达后,transwell法和细胞划痕法检测U0126对sh RNA和m Panx-1稳转细胞株细胞侵袭迁移的抑制作用;western blotting法检测侵袭迁移相关蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表达。结果:1.与睾丸间质细胞TM3相比,睾丸癌细胞中pannexin1蛋白表达量显著增多。Western blotting结果显示,相比睾丸间质细胞TM3,睾丸癌细胞Tcam-2、MLTC-1以及I-10中pannexin1表达量明显增高(P0.05)。2.CBX和PBN抑制pannexin1通道后,pannexin1通道功能下降。实时荧光传递实验发现:与control组相比,使用pannexin1通道抑制剂CBX和PBN后,细胞荧光传递能力明显下降(荧光传递强度反应pannexin1通道强弱)(P0.05);细胞外ATP检测实验(细胞外ATP水平高,pannexin1通道功能强)发现,与control组相比,使用CBX和PBN抑制pannexin1通道后,细胞外ATP含量明显降低(P0.05)。3.CBX、PBN抑制pannexin1通道后,睾丸癌I-10细胞侵袭迁移能力下降。Transwell和划痕结果表明:与Control组相比,CBX组和PBN组的迁移能力降低(P0.05);侵袭能力降低(P0.05)。促侵袭迁移蛋白MMP-9和vimentin表达量降低(P0.05);抑侵袭迁移蛋白E-cadherin表达量升高(P0.05)。4.沉默Panx-1可降低睾丸癌I-10细胞侵袭迁移能力。实时荧光传递实验发现:沉默Panx-1基因后,睾丸癌I-10细胞中pannexin1通道功能变弱(P0.05);ATP检测结果发现细胞外ATP水平降低(P0.05);transwell和细胞划痕实验发现沉默Panx-1后,睾丸癌细胞I-10侵袭迁移能力降低(P0.05)。Western blotting结果发现:促侵袭迁移蛋白MMP-9和vimentin表达量降低(P0.05);抑侵袭迁移蛋白E-cadherin表达量升高(P0.05)。5.过表达Panx-1增强睾丸癌I-10细胞侵袭迁移能力。实时荧光传递实验发现:过表达Panx-1基因后,睾丸癌I-10细胞中pannexin1通道功能变强(P0.05);ATP检测结果发现细胞外ATP水平增强(P0.05);transwell和细胞划痕实验发现过表达Panx-1后,睾丸癌细胞I-10侵袭迁移能力增强(P0.05);western blotting结果:促侵袭迁移蛋白MMP-9和vimentin表达量升高(P0.05);抑侵袭迁移蛋白E-cadherin表达量降低(P0.05)。6.在过表达Panx-1细胞株中,m Panx-1增强睾丸癌细胞侵袭迁移能力,U0126(p-ERK抑制剂)能显著降低过表达株细胞侵袭迁能力。Transwell和划痕实验发现,在过表达Panx-1基因细胞株中,与NC组和m Panx-1组相比,U0126+m Panx-1组能显著抑制睾丸癌细胞侵袭迁移(P0.05);western blotting实验发现,U0126+m Panx-1能显著抑制MMP-9和vimentin蛋白的表达,增强E-cadherin蛋白的表达(P0.05)。结论:1.Pannexin1通道蛋白在睾丸癌I-10细胞中表达量增加。2.Pannexin1通道促进睾丸癌I-10细胞侵袭迁移可能与增强p-ERK1/2蛋白的表达有关。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.21
【图文】：

标准曲线,标准曲线,离心管,记号笔

期间准备新的离心管，并用记号笔标记，按顺序排列好放于冰盒上，待离心完后，去离心后的上清液，转移至新的离心管中，避免蛋白污染和破坏。保存，行下一步实验。2.3.2 测定目标蛋白浓度2.3.2.1 根据蛋白标准曲线，制备上样液根据 BCA 试剂盒说明书，制备标准曲线：

睾丸癌,精原细胞,睾丸间质细胞,蛋白

Tcam-2 以及睾丸癌非精原细胞 MLTC-1 和 I-10 细胞中 Panx-1 蛋白的表达。Panx-1蛋白作为 Panx 蛋白家族中表达最多的蛋白，分子量 78KDa，在细胞膜上形成一个六聚体膜蛋白通道，参与细胞内外物质的交换。在离子电压差，机械压力和capase 剪切下，通道打开，释放 ATP，IP3 等信号分子，从而调控肿瘤细胞生长、凋亡和侵袭迁移等。图 2A 结果显示，与睾丸间质细胞 TM3 相比，睾丸癌精原细胞 Tcam-2 以及睾丸癌非精原细胞 MLTC-1 和 I-10 细胞中 Panx-1 蛋白表达显著性增多（P<0.001）。同时发现，与睾丸癌精原细胞 Tcam-2 相比，在睾丸癌非精原细胞 MLTC-1 和 I-10 中发现，Panx-1 蛋白表达量也明显较高，这种结果提示，Panx-1可能参与睾丸癌的发生发展，同时提示 Panx-1 在恶性程度较高的睾丸癌非精原细胞中表达增高。结合以上结果，提示我们 Panx-1 可能参与睾丸癌细胞的发生发展，至于Panx-1 表达量增多的含义，还需进一步验证。

【参考文献】