基质γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）相互作用蛋白的筛选研究

发布时间：2020-07-10 21:30

【摘要】：肾结石是泌尿外科常见病,发病率仅次于尿路感染和前列腺疾病,是泌尿外科第三大多发病,且具有较高复发率,临床常表现为肾脏功能损害和尿路梗阻。目前肾结石疾病的形成机制尚不明确,已有研究表明蛋白质与肾结石形成密切相关,在结石的形成过程中发挥着重要作用。基质γ-羧基谷氨酸蛋白(MGP)是由多个谷氨酸残基构成的维生素K依赖的分泌蛋白,在人体中多个组织器官中均有表达。目前已经确认其在调节细胞外基质钙化过程中起重要作用,且已发现其对血管钙化有抑制作用,并可能与骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein,BMP-2)的相互作用有关。一些研究发现MGP蛋白与肾结石形成也有密切相关性,其可能有抑制结晶形成的功能,但分子机制尚不清楚。而系统筛选和研究MGP的相互作用蛋白,能进一步阐明其与肾结石形成的关系和分子机制。因此本实验拟通过T7噬菌体展示系统从人cDNA文库中钓取MGP相互作用蛋白,并对其与互作蛋白之间的相互作用进行初步研究。首先,我们以pT7CFE1-NHis-GST-CHA为载体构建哺乳动物真核表达系统用的MGP表达质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP,通过蛋白体外表达系统得到大量的人源MGP蛋白。接着以体外表达得到的人MGP蛋白为诱饵蛋白,在ELISA板上进行包被,然后使用人cDNA文库T7噬菌体展示系统,筛选可能与MGP存在相互作用的多肽,Phage EILSA法进一步筛选验证所得多肽是否与MGP存在相互作用,筛选确认了SLC27A6等12个与MGP可能存在相互作用的候选互作蛋白。最后利用分子模拟的方法对MGP蛋白及SLC27A6进行了同源建模和分子对接研究,在计算机水平上确认了其存在相互作用,并初步研究了其蛋白相互作用的方式。综上所述,本实验成功构建了MGP的高效表达质粒,并在体外实现了MGP蛋白的高效表达,再以得到的MGP蛋白为诱饵蛋白,利用T7噬菌体表达筛选系统在体外成功的筛选验证得到了MGP的12个候选相互作用蛋白,为进一步研究MGP蛋白抑制肾结石形成的分子机制以及其他生理功能奠定了基础。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692.4
【图文】：

图 1-2 pMD19-MGP 质粒 EcoR I 和 Xho I 双酶切鉴定A Ladder；2,3：pMD19-MGP 质粒未经 EcoR I 和 Xho I 双酶切；4,5：经 EcoR I 和 Xho I 双酶切后的产物 的结果显示 5 号泳道中质粒 pMD19-MGP 经过 Eco

1-3 pT7CFE1-NHis-GST-CHA 质粒和 pMD19-MGP 质粒 EcoR I 和 Xho I 电泳图M：DL5000 DNA Makre；1：pT7CFE1-NHis-GST-CHA 质粒未经 EcoR I 和 Xho I 双酶切pT7CFE1-NHis-GST-CHA 质粒经 EcoR I 和 Xho I 双酶切后产物；3：pMD19-MGP 质粒未和 Xho I 双酶切；3-5：pMD19-MGP质粒经 EcoR I 和 Xho I双酶切后的产物

1-4 重组质粒 pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP 的 EcoR I 和 Xho I 双酶切M：DL5000 DNA Makre；1：未双酶切的重组 pT7CFE1-Nhis-GST-CHA-MGP 质粒2：重组质粒 pT7CFE1-Nhis-GST-CHA-MGP 经 EcoR I 和 Xho I 双酶切后的产物图 1-4 显示，2 号泳道的质粒经过酶切验证后在 4400bp 和 310b分片段，片段大小分别与 pT7CFE1-NHis-GST-CHA 和-MGP cD合。证明我们成功构建了 pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP 重组质进一步的扩增、纯化及体外表达。BCA 法测定 MGP 蛋白浓度们采用 BCA 蛋白测定方法对 1.3.5.2 所得的蛋白体外表达反应液，绘制蛋白浓度标准曲线。蛋白反应液稀释 10 倍后，由紫外分光光度计测得其 595nm 处吸其蛋白浓度为 4mg/ml。

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本文编号：2749471