长链非编码RNA在前列腺癌及膀胱癌发生发展中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-24 22:03

【摘要】：前列腺癌和膀胱癌分别是西方国家及我国发病率最高的泌尿系统肿瘤。尽管其在我国的发病率较常见的呼吸系统,消化系统恶性肿瘤略低,但随着社会老龄化趋势日益显现,前列腺癌及膀胱癌的发病率出现明显的上升趋势,其在恶性肿瘤研究中的重要性也越来越明显。虽然目前超声及CT等诊断技术的不断发展和普及大大提高了前列腺癌和膀胱癌的早期检出率,但仍有绝大部分患者在肿瘤晚期才因出现症状而就诊,导致治疗时机的延误。由于前列腺癌的发病率在西方人群所有肿瘤中位于首位,在肿瘤相关的死亡中位列第二,因而在西方国家关于前列腺癌的研究也始终是众多学者关注的热点。尽管我国尚属于前列腺癌发病率相对较低的地区,但由于近年来前列腺癌的发病率增速逐渐加快,使得国内关于前列腺癌发病机制的研究也逐渐升温。而关于在我国泌尿系统肿瘤中发病率最高的膀胱癌,其具有明显的高复发性,目前临床上尚无有效的治疗手段,且传统的病理分级分期方法在膀胱癌的生物行为预测方面作用有限。故深入研究前列腺癌和膀胱癌发生发展的分子生物学改变,将极大地有利于疾病的早期诊断及临床治疗,在推动科学研究和临床进展方面,均具有十分重要而积极的意义。与其他恶性肿瘤一样,前列腺癌和膀胱癌的的发生也是环境因素和遗传因素共同作用的结果。既往研究已发现一系列基因的变异及其引起的功能异常及相应的细胞生物学行为紊乱与前列腺癌和膀胱癌的发生有关。然而,随着肿瘤分子遗传机制的研究深入,人们逐渐发现表观遗传学机制,在肿瘤的发生过程中同样发挥着举足轻重的作用。目前研究较为广泛的表观遗传学机制主要包括染色质重塑,组蛋白修饰,DNA甲基化和调控型(非编码)RNA等。LncRNA,又称长链非编码RNA,是一类长度超过200nt,不具有蛋白编码功能的RNA。众多研究表明,lncRNA作为一种重要的表观遗传学形式,在细胞内的多个层面上发挥作用。此外lncRNA具有不同位置特点,导致其可能通过迥异的机制发挥其基因调控作用。随着基因组中lncRNA的不断发现,其在恶性肿瘤中的作用也受到研究者们越来越广泛的关注。在一些常见肿瘤,如肺癌,肝癌及乳腺癌等的研究中,都发现了特定lncRNA的异常表达,而这种异常往往提示lncRNA与肿瘤发生的生物学过程相关。而关于lncRNA具体作用机制的研究目前尚处于起步阶段,对于其在前列腺癌和膀胱癌中的作用,仍有待进一步阐释。本研究拟分别采用文献筛选和芯片筛选的策略,寻找在前列腺癌和膀胱癌中差异表达的lncRNA,并通过一系列分子生物学手段,阐明其在恶性肿瘤发生过程中的作用及可能的分子机制,为进一步揭示lncRNA在前列腺癌及膀胱癌发病机制中的作用提供了理论依据,并为今后泌尿系统肿瘤的个体化预防,早期干预及诊断等提供重要参考。第一部分LncRNA intronic-ABCAl参与前列腺癌发病机制的初步探讨研究背景：前列腺癌是在西方发达国家发病率最高的恶性肿瘤。ABCAl是近年来发现的具有重要功能的脂质转运大分子膜蛋白,它的主要生物学功能是胆固醇从细胞内转运至细胞外,并将其包装成为高密度脂蛋白,并通过此机制参与前列腺癌的发生发展。而在该基因区域存在的内含子区lncRNA则可能通过调控该基因表达,进而影响前列腺癌的发病过程。方法及结果：生物信息学查询也发现ABCAl所在区域存在一个内含子区lncRNA,本研究中将其命名为intronic-ABCAl。在前列腺癌及癌旁组织中进行RT-PCR表达检测发现,lncRNA intronic-ABCA1在前列腺癌组织中表达水平下降,而ABCA1 mRNA表达水平上升。构建intronic-ABCA1过表达质粒转染进前列腺癌细胞株中,发现其相邻编码基因ABCA1的表达水平被显著抑制,通过RT-PCR方法及Western blot方法分别在RNA水平和蛋白水平证实了该抑制效应。我们进而通过CCK-8实验及Transwell实验观察了intronic-ABCA1过表达对前列腺癌细胞增殖及迁移能力的影响,发现了其具有抑制细胞增殖及迁移能力的作用,并且这种作用可能与其对ABCA1表达量的调控有关。结论：本研究发现lncRNA intronic-ABCA1在前列腺癌组织中表达下调,其对ABCA1基因表达具有负向调节作用,且可抑制前列腺癌细胞的增殖及迁移能力。第二部分LncRNA MDC1-AS对膀胱癌的抑制作用及其分子机制研究研究背景：膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,且具有明显的高复发性。反义lncRNA通过多种机制参与生物学过程的调控。MDC1是细胞内DNA损伤应答过程中的重要分子,并且在多种肿瘤中发挥抑癌作用。方法及结果：我们对3对膀胱癌及癌旁组织进行了lncRNA表达谱芯片筛查,发现DNA修复基因MDC1的反义lncRNA在膀胱癌组织中显著低表达,本研究中将其命名为MDCl-AS。在随后扩大样本量的RT-PCR验证中,也证实了MDC1-AS在膀胱癌组织中显著下调,且其相邻编码基因MDC1在膀胱癌组织中也呈现低表达趋势,相关性分析表明二者的表达水平呈显著的正相关性。我们构建了MDC1-AS的过表达质粒,将其转染进膀胱癌细胞株EJ和T24中,发现,MDC1-AS对MDCl基因的mRNA水平及蛋白水平均有明显的上调作用。我们进而通过一系列细胞恶性表型实验,包括CCK-8, Transwell,平板克隆及流式细胞检测等方法,观察了MDC1-AS对多种细胞恶性表型的影响,结果发现MDC1-AS具有显著抑制膀胱癌细胞增殖,迁移及克隆形成的作用。最后,为探讨MDC1-AS对细胞表型的影响是否与其对MDC1的表达调控作用有关,我们采用siRNA的方法,干扰MDC1基因的表达,并且发现MDC1-AS对细胞恶性表型的抑制作用明显减弱,由此可推断MDC1-AS对细胞恶性表型的抑制作用是通过其对MDCl基因的正向调控作用实现的。结论：本研究发现lncRNAMDCl-AS具有显著的低表达趋势,且对其相邻编码基因MDC1的表达具有正向调节作用。MDC1-AS具有抑制膀胱癌细胞增殖,迁移及克隆形成的能力,并且这种抑制作用与其对MDC1的调控作用相关。本研究结果不仅阐释了lncRNA在泌尿系统恶性肿瘤发生发展中的作用,同时也为临床上寻找疾病新的生物标志物提供了线索,为深入理解lncRNA在恶性肿瘤中的作用及其机制提供了依据。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25;R737.14
【图文】：

组蛋白,转录本,基因转录,作用机制

不同的剪切方式，（２）多数ＩｎｃＲＮＡ的表达都具有时空特异巧Ｐｓｉ，（３）众多逡逑ＩｎｃＲＮＡ在疾病中呈现异常的表达方式ＰＷ。现有的研巧表明，ＩｎｃＲＮＡ作为一种逡逑重要的表观遗传学形式，在细胞内的多个层面上发挥着调控作用（见图１）。如，逡逑干扰邻近的编码基因表达；介导染色质重塑和组蛋白修饰；与编码蛋白基因的逡逑转录本形成互补双链，干扰ｍＲＮＡ剪切；与特定蛋白质结合改变蛋白质胞内定逡逑位等ＰＳ１。依据ＩｎｃＲＮＡ基因位置，可将其大致分为五类；１．同义；２．反义ＩｎｃＲＮＡ，逡逑即ＩｎｃＲＮＡ基因与同一链上的编码基因外显子全部或部分重叠，且其转录方向逡逑相同（同义）或相反（反义）；３．双向ＩｎｃＲＮＡ，指ＩｎｃＲＮＡ基因可从与其相邻逡逑的编码基因相同或相反两个方向转录；４．内含子ＩｎｃＲＮＡ，指ＩｎｃＲＮＡ完全转录逡逑１３逡逑

循环参数,目的

图１－１．邋ＲＴ－ＰＣＲ循环参数设置逡逑测得ｉｎｔｒｏｎｉｃ－ＡＢＣＡｌ及ＡＢＣＡ１邋相对表达量｜＾ｊｌ邋２－＆曰了计算，ＡＣｔ邋＝邋Ｃｔ邋（目的）－Ｃｔ邋（内逡逑参）0逡逑

序列,序列编码,网站,内含子

逦南京医科大学博±学位论文逡逑结果逡逑１．生物信息学网站查询结果逡逑通过数据查询，我们发现在编码基因＾公Ｇ４／附近，存在一个内含子区逡逑ＩｎｃＲＮＡ。该转录本长度为４６９ｂｐ，编号ＥＮＳＴ０００００４３５９１５，来自于９号染色体逡逑与＾公（心；基因内含子区转录本相反的ＤＮＡ链上。因此，我们将其命名为逡逑ｉｎｔｒｏｎｉｃ－ＡＢＣＡｌ邋0逡逑在生物信息学网站Ｃｏｄｉｎｇ邋Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ邋Ｔｏｏｌ邋（ＣＰＡＴ）上预测该逡逑ＩｎｃＲＮＡ序列的蛋白编码能力。如图１－２所示，该段序列并不具备蛋白编码的能逡逑力（ｃｏｄｉｎｇ邋ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ邋为邋０．０２６）。因此可确认邋ｉｎｔｒｏｎｉｃ－ＡＢＣＡｌ邋为NBＳＣ４／邋基因的逡逑内含子区ＩｎｃＲＮＡ。逡逑Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ邋Ｕｓｅｒ邋Ｇｕｉｄｅ邋Ｆｅｅｄｂａｃｋ邋Ｓｏｕｒｃｅ邋Ｃｏｄｅ逡逑

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