Tempol对缺血再灌注诱导的小鼠急性肾损伤的保护作用机制研究

发布时间：2020-07-25 19:34

【摘要】：目的:急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)是以肾功能迅速下降为主要特征的临床综合征,是引起慢性肾病,肾衰竭和死亡的重要因素之一。Tempol是一种抗氧化剂,可清除急性肾损伤时体内产生过多的自由基。本实验通过建立缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导的AKI小鼠模型,初步探讨Tempol对AKI小鼠肾脏的保护作用及其相关的机制。方法:将24只健康雄性C57B1/6小鼠,体重25～28 g,随机分为三组:(1)Sham组:小鼠开腹暴露30 min后随即关腹;(2)I/R组:小鼠单侧肾动脉夹闭30 min后恢复肾脏血流灌注;(3)Tempol+I/R组:腹腔注射Tempol(50 mg/kg)1h后,小鼠单侧肾动脉夹闭30 min然后恢复肾脏血流灌注。缺血复灌24h后处死小鼠,检测小鼠血清中的肌酐、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和氧化应激水平,通过希氏高碘酸染色观察肾脏组织的病理变化情况,用蛋白质印迹法检测肾组织中丝氨酸和苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated-Akt,p-Akt)、核转录因子 κB(nuclear factor κB,NF-κB)、蕾帕毒素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化 mTOR(phosphorylated-mTOR,p-mTOR)、氨基末端激酶(jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化 JNK(phosphorylated-JNK,p-JNK)、糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)、磷酸化 GSK3 β(phosphorylated-GSK3β,p-GSK3β)、p53和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白的表达水平,通过肾小球入球动脉灌注技术测量肾小球入球动脉直径变化从而展现出肾小球入球动脉对Ang Ⅱ的反应性变化。结果:(1)与Sham组比较,I/R组中小鼠血清中肌酐、BUN、超氧阴离子(superoxide anion,O2·-)和苯二醛(malonyldialdehyde,MDA)增加,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)减少。肾小管上皮细胞坏死增加。p-Akt、p-GSK3β、p-mTOR和Bcl-2蛋白表达下调,NF-κB、p-JNK和p53蛋白表达上调。此外,肾小球入球动脉对Ang Ⅱ的反应降低。(2)与I/R组比较,Tempol+I/R组小鼠血清中的肌酐、BUN降低、O2·-和MDA减少,SOD和CAT上升。肾小管上皮细胞坏死减少。p-Akt、p-GSK3β、p-mTOR和Bcl-2蛋白表达上调,NF-κB、p-JNK和p53蛋白表达下调。且肾小球入球动脉对AngⅡ的反应增强。结论:在缺血再灌注诱导的AKI小鼠模型中,Tempol对AKI小鼠肾脏组织有明显的保护作用,其保护作用机制是通过抗氧化作用,调控PI3K/Akt/mTOR和GSK3β信号通路,NF-κB的表达以及提高肾小球入球动脉的活性等方面来实现的。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

肌酐,缺血再灌注,血清,小鼠

图４．１小鼠缺血再灌注２４ｈ后血清中肌酐和ＢＵＮ的水平。（Ａ）邋Ｓｈａｍ组、Ｉ／Ｒ组Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋Ｉ／Ｒ组小鼠血清中肌酐的水平；（Ｂ）邋Ｓｈａｍ组、Ｉ／Ｒ组和Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋Ｉ／Ｒ组鼠血清中ＢＵＮ的水平。Ｍｅａｎ土邋ＳＥＭ（ｎ＝８），邋＊Ｐ＜ｆｔｆｔ５，与Ｓｈａｍ组相比；与Ｉ／Ｒ组相比。逡逑

缺血再灌注,小鼠血清,小鼠,组织形态结构

逦Ｓｈａｍ逦ｌ／Ｒ逦Ｔｅｍｐｏｌ＋Ｉ／Ｒ逡逑图４．２小鼠缺血再灌注２４邋ｈ后血清中氧化应激水平。（Ａ）邋Ｓｈａｍ组、Ｉ／Ｒ组和逡逑Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋Ｉ／Ｒ组小鼠血清中ＳＯＤ的水平；（Ｂ）邋Ｓｈａｍ组、Ｉ／Ｒ组和Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋Ｉ／Ｒ组逡逑小鼠血清中ＣＡＴ的水平；（Ｃ）邋Ｓｈａｍ组、Ｉ／Ｒ组和Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋１／Ｒ组小鼠血清中０２－逡逑的水平；（Ｄ）邋Ｓｈａｍ组、Ｉ／Ｒ组和Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋１／Ｒ组小鼠血清中ＭＤＡ的水平。Ｍｅａｎ逡逑土邋ＳＥＭ邋（ｎ＝５），0＜０．仍，与Ｓｈａｍ组相比；＃尸＜邋ｆｔ邋０５，与Ｉ／Ｒ组相比。逡逑４．３小鼠缺血再灌注２４邋ｈ后肾组织形态结构变化逡逑为了检测缺血再灌注对小鼠肾脏组织形态产生的影响，我们通过ＰＡＳ染色法，逡逑对小鼠缺血再灌注２４邋ｈ后的肾脏组织进行切片染色，观察其形态结构上的变化。逡逑１５逡逑

结构蛋白,细胞分化,缺血再灌注,再灌注

叫灥邋＿＿丨邋｜￡ｉｌｌｌ逦１１逡逑Ｓｈａｍ逦ｌ／Ｒ邋Ｔｅｍｐｏｌ＋Ｉ／Ｒ逡逑图４．４邋Ｓｈａｍ组、丨／Ｒ组和Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋Ｉ／Ｒ组小鼠肾脏组织中Ａｋｔ和ｐ－Ａｋｔ表达水平。逡逑Ｍｅａｎ邋土邋ＳＥＭ邋（ｎ＝５），ｆｔ邋０５，与邋Ｓｈａｍ邋组相比；＃邋尸邋＜邋ｆｔ邋０５，与邋Ｉ／Ｒ邋组相比。逡逑４．５邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ■检测邋ｍＴＯＲ邋和邋ｐ－ｍＴＯＲ邋表徶逡逑ｍＴＯＲ是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因逡逑子，调节细胞分化、增殖、存活和凋亡。实验结果表明，与Ｓｈａｍ组相比，缺血逡逑再灌注小鼠肾脏组织中磷酸化ｍＴＯＲ邋（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ－ｍＴＯＲ，ｐ－ｍＴＯＲ）表达明显逡逑下调，当给予Ｔｅｍｐｏｌ治疗缺血再灌注２４邋ｈ后，小鼠肾脏组织中ｐ－ｍＴＯＲ表达显逡逑著上调。逡逑＝１．５．逡逑．２逡逑Ｓｈａｍ邋ｌ／Ｒ邋Ｔｅｍｐｏｌ＋Ｉ／Ｒ邋｜逡逑ｐ－ｍＴＯＲ邋Ｍｍｍ逦，邋Ｖ逦ｓ逦Ｉ邋１．０－逦￣逡逑ｌｉＷｆｆ邋■逦ｒＷｍ邋．邋Ｊｇｇｇｌ逦２：逦Ｊ逡逑Ｏｆ逦＃逡逑逦Ｈ逦Ｏ逡逑＿邋丨灥呡ｉ！逦0，ｌ逦１．１逦＾逦Ｉ逡逑Ｓｈａｍ逦ｌ／Ｒ逦Ｔｅｍｐｏｌ＋Ｉ／Ｒ逡逑图４．５邋Ｓｈａｍ组、丨／Ｒ组和Ｔｅｍｐｏｌ邋＋邋Ｉ／Ｒ组小鼠肾脏组织中ｍＴＯＲ和ｐ－ｍＴＯＲ表达逡逑水平。Ｍｅａｎ士ＳＥＭ（ｎ＝５）

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