基于调控网络的前列腺癌细胞中E2F1调控机制及多靶点联合干扰的研究

发布时间：2020-07-25 20:07

【摘要】：第一章去势抵抗性前列腺癌细胞中E2F1调控的重要基因和通路去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)是前列腺癌治疗的一个巨大挑战。E2F转录因子1(E2F1)是CRPC中的一个重要因子,本研究的主要目的是发现E2F1通过调控哪些基因和通路来影响CRPC的细胞学行为。通过shRNA技术构建稳转敲低E2F1的CRPC细胞株PC3和DU145。采用流式细胞术、CCK8、transwell等方法检测细胞(敲低E2F1的PC3和DU145)细胞学功能。用RNA-seq(RNA-sequencing)检测敲低E2F1后细胞基因的表达水平,找到差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。使用GeneMANIA数据库进行基因共表达分析,GEPIA数据库进行相关性分析。通过Metascape数据库进行差异表达基因的通路富集。利用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。使用Cytoscape软件筛选Hub基因。通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和GEPIA等数据库对DEGs表达水平进行验证。敲低E2F1抑制PC3细胞的增殖并促进其凋亡,但对DU145细胞则无该影响。敲低E2F1均能降低PC3和DU145细胞的侵袭和迁移能力。敲低E2F1后,PC3细胞鉴定出了1811个DEGs,其中800个基因出现上调,1011个基因出现下调。而敲低DU145细胞的E2F1后出现27个差异表达基因,包括6个基因上调和21个基因下调。获得这两个细胞的overlapped DEGs,包括CFH、IL1RL1、EVA1C、TMOD2、AIF1L、WIPF3、NXPH4、KREMEN2、PI3和E2F1。基因共表达分析显示,KREMEN2和TMOD2分别与E2F1共表达,独立于其他的overlapped DEG。相关分析说明CFH,IL1RL1,EVA1C,WIPF3,NXPH4,KREMEN2与E2F1正相关。PC3和DU145组的overlapped DEG仅富集在一个通路上:肌动蛋白丝组织通路(actin filament organization)。对PC3组进行模块分析获得总共有153个node和624个edge。筛选出10个hub DEGs,包括CCL2、FGF2、TLR2、CDH1、PTGS2、SHH、C3、VEGFA、PECAM1和CXCR4。此外,还找到了PC3中的一些其他重要的DEGs,包括NOTCH3、BID和STAT1。RT-qPCR验证了两株细胞的5个overlapped DEGs,PC3细胞的3个DEGs。EVA1C、IL1RL1和PTGS2可作为前列腺癌的潜在诊断标志物。E2F1通过改变CRPC中一些基因如TMOD2的表达水平,在调节肌动蛋白丝组织通路中起着至关重要的作用,继而改变CRPC细胞的细胞学功能。第二章E2F1的敲除对前列腺癌细胞功能的影响及前列腺癌中E2F1调控机制的研究通过前期构建的调控网络,发现E2F1可能受到多个上游基因的调控,也调控多个基因的表达。然而,E2F1在前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)细胞调控的基因并不明确,并且缺乏E2F1负调控下一基因的报道。因此,我们试图找到敲除E2F1对PCa细胞学功能的影响以及E2F1在基因组和转录组水平上调控哪些重要的基因。通过CRISPR/Cas9技术构建敲除E2F1的PC3细胞。采用蛋白免疫印迹技术检测E2F1在细胞中的敲除效果。流式细胞术、CCK8、transwell检测细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭。并结合RNA-seq结果,分析前列腺癌细胞中E2F1的Ch IP-seq结果,找到受到E2F1正负调控的基因。RT-q PCR验证这些基因。运用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除E2F1的PC3细胞株。敲除E2F1后的PC3细胞增殖能力显著降低(P0.01),对PC3细胞凋亡水平没有显著影响(P0.05),敲除E2F1后的PC3细胞侵袭能力显著降低(P0.01),敲除E2F1后的PC3细胞迁移能力极显著降低(P0.001)。上一章中10个overlapped基因,包括TMOD2,AIF1L,CFH,IL1RL1,EVA1C,WIPF3,NXPH4,KREMEN2和PI3均可以与E2F1结合。证实了E2F1可以通过调节TMOD2和AIF1L参与细胞肌动蛋白组织以调节细胞骨架。RT-q PCR验证了PC3细胞中E2F1的敲除能够显著下调TMOD2和AIF1L,上调CFH,IL1RL1和EVA1C的表达。敲除E2F1后,CFH,IL1RL1和EVA1C表达水平升高,证明在PCa中确实存在可以被E2F1负调控的靶基因。一方面,证实了E2F1可以通过调节TMOD2和AIF1L参与调节细胞肌动蛋白以影响细胞骨架,继而影响细胞学功能。另一方面,填补了E2F1负调控下一基因这一空白,完善了前列腺癌中E2F1的分子调控网络。第三章基于调控网络的前列腺癌细胞中多靶点联合干扰的研究前列腺癌(Prostate Cancer)患者经进一步去势和/或抗雄激素药物治疗一段时间后,大部分发展成为去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)。我们前期研究通过文本挖掘构建调控网络的负反馈环发现,如果我们同时控制E2F1、MEK和NF-κB三个靶点,将有效地控制雄激素受体(Androgen Receptor,AR)的表达,这将为CRPC的治疗提供有意义联合治疗靶点。通过sh RNA技术构建敲低E2F1的稳转非雄激素依赖CRPC细胞株PC3、DU145和雄激素依赖PCa细胞株LNCa P。使用蛋白免疫印迹技术和免疫荧光技术分别检测抑制剂对MEK和NF-κB的抑制效果。通过流式细胞术、CCK-8、transwell检测E2F1、MEK和NF-κB三个靶点的联合干扰对三株细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭方面的影响。荧光定量PCR技术(RTq PCR)检测三个靶点的联合干扰对肿瘤行为相关基因(MMP2、VEGFA、CDH1、BCL-2)表达的影响。由RNA-sequencing(RNA-seq)结果分析CRPC细胞的差异表达基因(Different expression genes,DEGs),通过DEGs的通路富集分析以找到联合干扰三个靶点后哪些重要的通路等发生了变化。通过PPI网络的构建和分析找到主要发生改变的模块。通过hub基因(hub gene)的获得以了解联合干扰后什哪些关键基因发生了改变。20μM PD0325901和5μM SC75741作用48h,可以对敲低E2F1的CRPC细胞的MEK和NF-κB产生良好的抑制效果。对三个靶点进行联合干扰后,PC3、DU145和LNCa P三株细胞的增殖能力极显著降低(P0.001),且低于加入CRPC治疗的临床药物阿比特龙的阳性对照组。联合干扰后,PC3(P0.001)和DU145(P0.05)细胞的侵袭能力下降,且低于阳性对照组。联合干扰可以使PC3(P0.001)、DU145(P0.05)和LNCa P(P0.001)细胞的迁移能力下降,且低于阳性对照组;联合干扰三株细胞,显著增强细胞的凋亡(P0.001),且高于阳性对照组。联合干扰后,PC3细胞的MMP2基因表达水平极显著表达上调(P0.001),DU145细胞的MMP2基因则出现了极显著下调的情况(P0.001)。联合干扰后VEGFA、BCL-2、CDH1三个基因表达水平,在PC3、DU145细胞中均出现显著或极显著下调(P0.01或P0.001),且表达水平均低于阳性对照组。联合干扰后PC3细胞出现的745个DEGs,其中316个基因上调,429个基因下调。DEGs富集在包括细胞因子介导的信号通路、病毒防御反应通路、前期染色体的凝结通路、趋化性通路和细胞分裂通路等重要的通路上。发差异表达基因对细胞的影响主要包括4个主要的簇状通路:影响染色体的通路,关于趋化性的通路、关于干扰素的通路以及关于细胞行为的通路等。找到包括IL6、BIRC5、CDH1、PLK1、CDK1、CDC20等基因在内的20个hub基因。与正常组织相比,BIRC5、CCNB1、CDC20、CDH1、TOP2A和UBE2C基因在前列腺癌组织中出现了差异表达的情况,具有统计学意义(P0.05)。BIRC5、CCNA2、KIF2C、PLK1和CDC20与前列腺癌患者的总生存率相关,具有统计学意义(P0.05)。(8)BIRC5和CDC20在差异表达和生存分析中均有显著差异,有望成为前列腺癌诊断、预后的新指标。E2F1、MEK和NF-κB三个靶点的联合干扰抑制CRPC细胞PC3、DU145,甚至是雄激素依赖细胞LNCa P的增殖、侵袭和迁移,促进他们的凋亡,显著下调多个肿瘤行为相关基因,这将为CRPC的治疗提供有意义联合治疗靶点。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.25
【图文】：

细胞,细胞凋亡,细胞功能,早期凋亡

在两种细胞系中， E2F1 表达确实已经被抑制，敲低 E2F1 的 CRPC 细胞株已经成功构建。（P < 0.001，图1-1C，D）。图 1-1 构建敲低 E2F1 的 PC3 和 DU145 细胞Figure 1-1 The construction of PC3 and DU145 cells by the downregulating of E2F1 expression.The phenotypic characterization of PC3 (A) and DU145 (B) groups; ‘vector’, empty vector as negativecontrol; ‘shE2F1’, shRNAfor E2F1. The expression of the E2F1 was suppressed by shE2F1 in PC3(C) andDU145 (D). Statistical significance was calculated using an independent-sample t-test. *p<0.05, **p<0.01.为了研究 E2F1 对 CRPC 细胞功能的影响，我们检测了敲低 E2F1 后DU145 和 PC3 细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭。如图 1-2A 所示，对于PC3_vector、PC3_shE2F1 细胞，早期细胞凋亡从 1.4％增加至 22.3％，而晚期细胞凋亡从 0.5％增加至 4.6％，最显着的变化发生在早期凋亡阶段（P <0.001）。与之相比，在 DU145 细胞中

细胞功能,细胞的,测序,样本

图 1-2 构建敲低 E2F1 的 PC3 和 DU145 细胞的细胞功能学实验Figure 1-2 The cellular function of PC3 and DU145 cells with knock-down of E2F1Flow cytometry study of PC3 and DU145 groups stained withAnnexin VAPC/7-AAD (A). PC3 (B) andDU145 (C) proliferation level detected by CCK-8 kit. PC3 cell migration (D) and invasion (E) and DU145cell migration (F) and invasion (G) were detected using transwell assays. Statistical significance wascalculated using an independent-sample t-test. *P<0.05, **P<0.01.3.2 E2F1 基因敲低后 RNA 测序数据的基本情况为了研究在 CRPC 中 E2F1 的分子调控机制，使用 RNA-seq 分析了敲低 E2F1 后 PC3 和 DU145 细胞及其对照的转录谱。共有 12 个测序样本，每组有 3 个重复。每组样本（包括 PC3_vector、DU145_vector、PC3_shE2F1和 DU145_shE2F1 组）的重复的致性良好（图 1-3A、1-3B）。

数据质量,细胞的,转录本,表达差异

图 1-3 RNA-seq 结果的数据质量Figure 1-3 Data quality of RNA-Seq. Replicate samples was clustered in the same groups, including thegroup of PC3_vector, PC3_shE2F1, DU145_vector, PC3_shE2F1 (A). The correlation analysis result wasthe same as the PCAresult (B).3.3 E2F1 敲低 CRPC 细胞的相关差异表达基因在我们的 RNA-seq 数据中，每种类型的细胞总共有 26,354 个注释的转录本。通过计算和分析 PC3_vector 与 PC3_shE2F1 之间各基因的差异表达（Differentiallyexpressedgenes,DEGs），鉴定出 1811 个 DEGs，其中包括800 个上调基因和 1011 个下调基因（图 1-4A 和表 S2）， PC3 细胞的 DEGs表达差异显示于图 4B 中。并且，DU145_vector 和 DU145_shE2F1 相比，有

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